Le pneumocoque

Contacts : T.Vernet, A.M. Di Guilmi, A.Zapun, C.Durmort

Notre groupe s’intéresse à la biologie du pneumocoque, un important pathogène pour l’homme, à travers l’étude des relations entre la bactérie et son hôte, le métabolisme de la paroi et la division cellulaire, ainsi que sa résistance aux antibiotiques de type béta-lactamines.

Les infections à pneumocoques sont responsables de plus d’un million de morts par an dans le monde. Le pneumocoque est un coque à Gram positif, d’aspect lancéolé, qui colonise de façon asymptomatique le naso-pharynx, mais qui cause diverses maladies lorsqu’il colonise d’autres sites ou tissus : otites, sinusites, pneumonies, méningites et septicémies. Aujourd’hui, en France, près de la moitié des isolats de S. pneumoniae sont résistants à plusieurs antibiotiques, en particulier aux béta-lactamines (pénicillines). Les vaccins commercialisés sont relativement efficaces mais ne couvrent pas tous les sérotypes virulents, et perdent progressivement leur efficacité par la sélection des souches non couvertes.

La paroi bactérienne est un objet d’étude important à plusieurs titres :

Elle est le siège de nombreux facteurs de virulence protéiques qui interviennent dans les interactions entre le pneumocoque et les tissus humains. Ces protéines de surface peuvent être impliquées dans l’adhésion aux cellules humaines, leur invasion, ou encore l’échappement au système immunitaire. Comprendre le rôle des protéines de surface est fondamental pour comprendre l’origine des maladies causées par le pneumocoque. Les facteurs de virulences peuvent également constituer de prometteurs antigènes vaccinaux ou des cibles pour des antibiotiques ayant des modes d’action nouveaux. Le constituant principal de la paroi est le peptidoglycane, un polymère de disaccharides et de peptides qui entoure entièrement la cellule, lui confère sa forme et la protège de sa pression osmotique interne. Plusieurs classes d’antibiotiques comme les béta-lactamines (dont font partie les pénicillines) ou les glycopeptides (vancomycine) agissent en empéchant la synthèse du peptidoglycane. Les enzymes responsables de son assemblage sont les cibles des béta-lactamines, les Penicillin-Binding Proteins (PBPs). Leur mécanisme d’action reste mystérieux comme l’organisation du peptidoglycane lui-même. Une autre question fondamentale est celle de la régulation de la synthèse de la paroi lors de la division cellulaire, en relation avec les autres processus avec lesquels elle est coordonnée : invagination de la membrane et ségrégation des chromosomes.

Protéines de surface et virulence

De nombreuses questions concernant la physiopathologie du pneumocoque restent non élucidées. Nous cherchons à comprendre comment la bactérie, à partir de la colonisation asymptomatique du nasopharynx peut envahir les sites stériles (poumons, sang, méninges) et causer des maladies. De façon plus précise, il est nécessaire de comprendre comment le pneumocoque identifie son environnement afin d’adapter son métabolisme, adhèrer et envahir les tissus de l’hôte, et échapper au système immunitaire inné. De nombreuses protéines présentes à la surface du pneumocoque jouent des rôles très importants dans ces processus en interagissant avec divers composants de l’hôte. La caractérisation structurale et fonctionnelle détaillée de ces interactions est indispensable pour comprendre les mécanismes moléculaires de la pathogénie du pneumocoque.

Adaptation métabolique en fonction de l’environnement

La colonisation du nasopharynx, l’invasion d’autres tissus par le pneumocoque et son adaptation à des changements drastiques de son environnement, sont des étapes déterminantes du processus de virulence, dont les acteurs clés sont les protéines présentes en surface de S. pneumoniae. Ainsi, nous avons caractérisé AdcAII, une lipoprotéine de surface qui lie le zinc. La structure cristallographique de la protéine recombinante a confirmé la spécificité de la liaison à un atome de zinc (Loisel et al. 2008, LCCP) et son homologie avec les transporteurs de type ABC. De plus, la présence de zinc dans un milieu de culture minimal dont les concentrations en métaux sont contrôlées, réprime l’expression du gène de adcAII dans la souche de pneumocoque R6. Nous explorons les mécanismes de régulation de l’import et de l’export du zinc, ainsi que les relations possibles entre le contrôle du zinc et les interactions avec l’hôte humain.

Structure cristallographique de AdcAII qui lie un atome de zinc. (Loisel et al. 2008)

Criblage des interactions pneumocoque – hôte

Un criblage in vitro d’interactions moléculaires utilisant un répertoire étendu de protéines de surface du pneumocoque produites sous forme recombinantes a révélé de nouvelles interactions avec des protéines humaines de la matrice extracellulaire et du système immunitaire inné. Des anticorps dirigés contre certaines de ces protéines ont été identifiés dans des collections de sera humain (collaboration C.-A. Siegrist, Genève). Ces protéines de surface du pneumocoque constitutent des antigènes vaccinaux potentiels. Nous étudions également la signification biologique des nouvelles interactions révélées par ce criblage à travers l’analyse détaillée des interactions, de la fonction in vivo et in vitro, et de la structure à haute résolution des protéines du pneumocoque qui y participent (Zhang et al. 2009).

Traversée des barrières épithéliales et endothéliales par la voie inter-cellulaire

La structure cristallographique de CBPE (choline binding proteine E) a été réssolue (Garau et al. 2005, LPM). Nous avons montré que CBPE participe au recrutement du plasminogène humain à la surface du pneumocoque. L’interaction entre CBPE et le plasminogène est réalisée par les domaines Kringle de ce dernier. Le plasminogène ainsi recruté peut être activé en plasmine dont l’activité protéolytique est alors exploitée par le pneumocoque pour l’invasion des tissus, à travers la matrice extracellulaire et les jonctions inter-endothéliales (Attali et al. 2008).

Déstabilisation des jonctions intercellulaires par des pneumocoques porteurs de plasmine/plaminogène. (Attali et al. 2008)

Structure et fonction du pilus chez le pneumocoque La présence de pili a récemment été découverte en surface de bactéries Gram-positives ainsi que chez des souches de pneumocoque et jouent un rôle dans l’adhérence des bactéries sur les tissus hôtes. La structure fibrillaire du pilus est constituée par la polymérisation de la protéine RrgB sur laquelle sont fixées les pilines mineures RrgA et RrgC. Toutes les associations entre pilines sont de nature covalente et sont catalysées par des enzymes nommées sortases. Nous nous intéressons aux mécanismes moléculaires d’assemblage du pilus. Les structures cristallographiques des trois sortases impliquées dans la formation du pilus chez le pneumocoque ont été déterminées en collaboration avec l’équipe Pathogénie bactérienne dirigée par Andrea Dessen à l’IBS (Manzano et al. 2008). Afin de décrypter les étapes d’assemblages du pilus, un système de co-expression des pilines et sortases a été développé au laboratoire, conduisant à la mise en évidence d’un certain nombre d’associations covalentes entre différentes pilines. Nous avons ainsi pu montrer que la sortase C-1 est l’enzyme catalysant la polymérisation de la fibre RrgB. La piline mineure RrgA porte la fonction d’adhésion aux cellules hôtes, et la résolution de sa structure cristallographique permettra d’identifier les sites d’interaction (Izoré et al. 2009). Chacune des pilines possède des liaisons covalentes internes, dont la formation entre des résidus lysine et asparagine est autocatalyzées par un glutamate ou un aspartate. Ces ponts intramoléculaires ont été mis en évidence par des approches de mutagenèse dirigée et analyse par spectrométrie de masse. Leur rôle dans la stabilisation des protéines a été montré par protéolyse limitée et dénaturation thermique.

Localisation de la piline majeure RrgB (orange) en surface de la souche de pneumocoque TIGR4. L’ADN est en bleu.

Paroi cellulaire et division

Les travaux menés au laboratoire depuis plusieurs années sur les mécanismes de la résistance aux béta-lactamines ont évolué récemment vers l’étude de la synthèse du peptidoglycane. L’assemblage du peptidoglycane, le constituant majeur de la paroi, est catalysé par les PBPs (Penicillin-Binding Proteins) qui sont aussi la cible des béta-lactamines. La réaction des PBPs avec les antibiotiques est bien connue, les mécanismes de résistance aux béta-lactamines due à des mutations des PBPs sont également bien connus, structuralement et enzymatiquement (Carapito et al. 2006, Job et al. 2008, Zapun et al. 2008a, LPM). Paradoxalement, les réactions physiologiques de synthèse du peptidoglycane catalysées par les PBPs sont très mal connues. Comprendre comment les PBPs modifiées sous la pression de sélection par les antibiotiques restent fonctionnelles pour la synthèse de la paroi devrait fournir de nouvelles pistes pour combattre la résistance.

Structure cristallographique d’un variant de PBP1a qui confère une haute résistance aux beta-lactamines. (Job et al. 2008)

Nous tentons actuellement de reproduire la synthèse du peptidoglycane de pneumocoque in vitro par la reconstitution de complexes de protéines membranaires qui incluent les PBPs et des protéines accessoires, comme FtsW ou RodA. Les protéines recombinantes membranaires sont produites chez E. coli grâce à l’expertise développée récemment par la plateforme RoBioMol.

La division et la synthèse de la paroi sont des processus intimement liés (Zapun et al. 2008b), et nous étudions la structure et la fonction de complexes de protéines de la division, comme DivIB, DivIC et FtsL (Noirclerc et al. 2005), qui pourraient également jouer un rôle dans la synthèse du peptidoglycane. La structure de ce complexe a été étudiée en solution par les méthodes de RMN, SAXS et SANS. Il est apparu qu’une face d’un domaine de DivIB interagit avec l’extrémité C-terminale d’une structure allongée formée par le dimère « coiled-coil » de DivIC et FtsL.

Ab initio model from SANS data of a soluble form of the complex DivIB/FtsL/DivIC. (Masson et al. 2009)

La délétion de divIB chez le pneumocoque affecte la division et la séparation des cellules filles, et accroît la susceptibilité aux beta-lactamines (Le Gouellec et al. 2008). La localisation des protéines de la division et de la synthèse de la paroi dans diverses conditions est étudiée par immunofluorescence ou par l’utilisation de fusion-GFP.

Morphologie d’un pneumocoque sauvage (R6) et d’un mutant de délétion (deltadivIB) qui n’exprime pas la protéine de division DivIB. (Le Gouellec et al. 2008, collab. O. Massidda, Università di Cagliari, Italie)

Localisation de la protéine de fusion GFP-DivIB exprimée chez le pneumocoque.