Canaux ioniques, Recepteurs et Transporteurs

Equipe

• Jean Revilloud, assistant ingénieur CNRS
• Christophe Moreau, postdoc
• Julien Dupuis, doctorant
• Lydia Caro, doctorante

Mécanismes moléculaires et ingénierie des canaux ioniques et protéines associées

Nous étudions les mécanismes moléculaires de la fonction et de la pharmacologie des canaux ioniques et des protéines membranaires qui peuvent leur être associées comme les protéines ABC et les récepteurs couplés aux protéines G. Nos travaux font une large place aux techniques d’électrophysiologie spécifiques des canaux ioniques (patch clamp, double microélectrode) ainsi qu’aux techniques d’ingénierie des protéines.

Notre modèle de prédilection est le canal potassique sensible à l’ATP (KATP) qui résulte de l’assemblage d’un canal K+ (Kir6.2) et d’une protéine ABC (SUR). Ce canal qui a un rôle clef dans la sécrétion d’insuline et dans la régulation de l’activité cardiaque et neuronale constitue une cible thérapeutique majeure. Nous étudions la modulation physiologique et pharmacologique de ce canal, les relations structure-fonction de SUR et des protéines ABC homologues, MRP1, P-gp, CFTR et YCF1, et les interactions entre protéines membranaires au sein de complexes naturels (SUR et Kir6.2) et de complexes artificiels susceptibles de servir de biocapteurs.

Legende : Secondary structure and molecular models of the 2 subunits of KATP channel. (A) Kir6.2 ( 400 amino acids) and SUR ( 1600 amino acids) are the constitutive subunits of the KATP channel. Four subunits of the inwardly-rectifying K+ channel, Kir6.1 or Kir6.2, associate with four ATP-binding cassette proteins, SUR, to form a functional KATP channel octamer. Kir6.x has two transmembrane helices M1 and M2, and a large cytoplasmic domain harboring an inhibitory binding site for ATP formed by the proximal C-terminal of one subunit and the N-terminal of its neighbor. SUR possesses 3 transmembrane domains (TMD0,1&2), and 2 cytoplasmic nucleotide binding domains (NBD1&2) incorporating the Walker A, Walker B and Linker L consensus sequences. NBD1&2 probably function as a dimer with nucleotide sites made up of Walker A&B of one NBD and linker L of the other. Cytoplasmic loops L0 and L1 are indicated. (B&C) Homology model of the Kir6.2 tetramer based on the KirBac1.1 structure (center) and model of Sav1866 together with a cartoon representation of TMD0&L0 in yellow. Panel B is a side view with 2 Sav1866 and TMD0 and a Kir6.2 tetramer. Panel C is viewed from the extracellular side of the full complex. The relative position of the subunits is arbitrary. Alpha-helices are in red and beta-sheets are in blue. ATP in the Kir6.2 and NBD sites is in green.

Legende : KATP channels and insulin secretion in pancreatic b-cells.(A) In pancreatic b-cells, glucose is shuttled in the cytosol by the glucose transporter GLUT2 and metabolized by glucokinase (GK) and mitochondria to produce ATP from ADP. Cytosolic ATP raises and ADP decreases.These changes cause closure of KATP channels by the cumulative effects of increased inhibition of Kir6.2 by ATP and decreased activation of SUR1 by MgADP. The ensuing depolarization elicits opening of voltage-dependent Ca2+ channels, Ca2+ entry, and Ca2+-initiated insulin granules exocytosis. Co-secreted Zn2+ could reactivate KATP channels in a negative feedback loop. KATP channel blockers like sulfonylureas mimick high glucose and upregulate secretion while openers like diazoxide downregulate secretion. (B) In cartoon form, the b-cell produces insulin as a function of glucose. Output is increased by high glucose, channel blockers, or channel-disabling hyperinsulinemic mutations. It is decreased by low glucose, openers, or channel-activating diabetic mutations.

Mécanisme d’action des régulateurs du canal KATP

Le canal KATP est modulé via SUR par les nucléotides ATP et ADP ainsi que par un grand nombre de molécules, bloqueurs aux propriétés antidiabétiques et ouvreurs aux propriétés antihypertensives et antiischémiques. Par des approches de mutagenèse et de constructions de chimères, nous recherchons les structures de SUR responsables de la liaison de ces agents et du couplage à la sous-unité canal, Kir6.2.

Légende:Fundamental role of 2 residues of the last transmembrane helix of SUR in mediating KATP channel activation by openers. KATP channels were reconstituted in Xenopus oocytes by coexpression of the Kir6.2 subunit with wild-type or modified SUR subunits and functionnally assayed in excised inside-out patch-clamp recordings. The opener response of these channels reflects the binding of the opener to the SUR subunit. SR47063, a cromakalim analogue, was used as a test opener at a saturating concentration. Progressively smaller regions of SUR2A were transferred in SUR1 until single residues were found to be sufficient to confer to SUR1 the capacity to respond to chemically distinct openers.

Pharmacologie des protéines ABC

Etude des relations structure-activité des ligands des transporteurs ABC par synthèse et criblage de nouveaux composés et étude de leur spécificité en utilisant des tests croisés entre différents transporteurs ABC..

Dans cette famille d’intérêt thérapeutique majeur, nous nous focalisons sur quelques protéines fortement homologues :

• SUR, le récepteur des sulfonylurées, est la sous-unité régulatrice du canal KATP.
• MRP1 et P-gp, pompes de ’Multidrug resistance’ responsables de la résistance des tumeurs aux anticancéreux.
• CFTR, canal chlorure impliqué dans la mucoviscidose
• YCF1, qui transporte les métaux lourds et permet à la levure de résister aux métaux toxiques comme le cadmium.

Légende : Topology and function of ABC family members having sequence homologies with SUR

Nouvelles approches d’étude des transporteurs et récepteurs

Conception de protéines hybrides entre canaux ioniques et récepteurs GPCR ou transporteurs ABC susceptibles d’être caractérisées par des techniques électrophysiologiques et intégrées dans des microsystèmes électroniques. Ce travail est poursuivi dans le cadre du projet européen Receptronics (www.receptronics.org).

Légende : The 3 levels of development of biosensing devices for diagnostics and screening as envisioned in the European Project Receptronics (Label-free Biomolecular Detectors : at the Convergence of Bioengineered Receptors and Microelectronics)

Techniques utilisées et mots clés

Mots clés :

Canal ionique – canal K+ - canal K-ATP - Transporteur ABC – YCF1 – SUR – MRP1 – P-glycoprotein - biocapteur

Techniques utilisées :

Construction de mutants, chimères, protéines de fusion – Expression hétérologue dans l’ovocyte de Xénope – Patch-clamp – Double-microélectrode – Mesure d’expression de surface de protéines membranaires par chimioluminescence – Western blot – Mesure d’activité ATPase par fluorescence – Bioinformatique et modélisation moléculaire.