Menu
Institut de Biologie StructuraleGrenoble / France

Faits marquants

Dommages causés par l’irradiation X et limites en dose en cristallographie sérielle

La cristallographie aux rayons X est la méthode la plus utilisée pour déterminer la structure des macromolécules biologiques – protéines, ADN, ARN et complexes formés entre ceux-ci. Elle est cependant limitée par le fort dommage induit par l’irradiation X aux molécules biologiques. Pour réduire ces dommages, les expériences de cristallographie aux rayons X sont généralement conduites à températures cryogéniques, bloquant parfois une hétérogénéité conformationnelle importante pour la fonction biologique. Avec l’avènement de la cristallographie sérielle – où chaque cristal n’est exposé qu’une seule fois permettant une distribution de la dose sur des milliers de cristaux plutôt que sur un seul – les expériences de cristallographie à température ambiante sont cependant de plus en plus fréquentes, lesquelles pourraient permettre des études structurales résolues en temps sur pratiquement tous les systèmes biologiques. Il convient cependant de savoir quelle dose de rayons X peut être déposée sur chaque cristal, à température ambiante, avant que l’information biologique enregistrée sur ce dernier soit compromise ; on parle de limite en dose. Grâce à une méthode nouvelle de cristallographie sérielle, prenant avantage à la fois du faisceau micro-focalisé et du détecteur de dernière génération disponibles sur la ligne ID13 de l’ESRF, les chercheurs de l’IBS, de l’ESRF et de l’ILL, en collaboration avec des collègues des Universités d’Oxford, de San Francisco et de Notre Dame, ont pu déterminer cette limite en dose et mettre en évidence les dommages spécifiques causés aux macromolécules biologiques par l’irradiation X à température ambiante. Cette limite en dose est une information importante pour la conduite des futures expériences de cristallographie sérielle à température ambiante, dans les synchrotrons de 4ème génération. L’ESRF-EBS en est le tout premier exemplaire.

Radiation damage and dose limits in serial synchrotron crystallography at cryo- and room temperatures. Eugenio de la Mora, Nicolas Coquelle, Charles S. Bury, Martin Rosenthal, James M. Holton, Ian Carmichael, Elspeth F. Garman, Manfred Burghammer, Jacques-Philippe Colletier, and Martin Weik . PNAS ; doi.org/10.1073/pnas.1821522117

Mécanisme photo-réactionnel d’une protéine fluorescente photo-commutable

Les protéines fluorescentes photo-commutables sont utilisées comme marqueurs en biologie pour imager les cellules à une résolution allant jusqu’à quelques dizaines de nanomètres. A dessein, lesdites protéines sont successivement éteintes puis allumées par illumination alternée à deux longueurs d’ondes spécifiques de la lumière visible. Les commutations entre l’état non-fluorescent (off) et l’état fluorescent (on) sont très rapides et impliquent des passages dans des états excités qui se forment en quelques picosecondes (i.e. des millièmes de milliardièmes de seconde) qui ont été caractérisés structurallement récemment. Les changements conformationnels sur des échelles de temps plus lentes, cependant, restaient longtemps insaisissables, laissant ouverte la question du mécanisme photo-réactionnel dans les protéines fluorescentes réversiblement photo-commutables. Grace à une combinaison de cristallographie sérielle résolue en temps sur le laser X à électrons libres (XFEL) SACLA, au Japon, et de spectroscopie d’absorption transitoire, des chercheurs de l’IBS (groupes DYNAMOP, M&P et EBEV), de l’ILL et des Universités de Lille et de Rennes, en collaboration avec les Instituts Max-Planck de Heidelberg et de Göttingen, ont pu clarifier ce mécanisme, apportant pour la première fois une vision structurale d’un état intermédiaire clef (i.e. de celui adopté 10 nanosecondes après photo-excitation de l’état off ; cf. figure). Ce travail tranche un débat long de 10 ans sur l’ordre des évènements réactionnels lors de la photocommutation de l’état off vers l’état on au sein des protéines fluorescentes réversiblement photo-commutables et devrait contribuer à leur optimisation rationnelle pour des applications diverses et toujours augmentées en imagerie du vivant.

Photoswitching mechanism of a fluorescent protein revealed by time-resolved serial femtosecond crystallography and transient absorption spectroscopy. Woodhouse J, Nass-Kovacs G, Coquelle N, Uriarte LM, Adam V, Barends TRM, Byrdin M,. de la Mora E, Doak RB, Feliks M, Field M, Fieschi F, Guillon V, Jakobs S, Joti Y, Macheboeuf P, Motomura K, Nass K, Owada S, Roome CM, Ruckebusch C, Schirò G, Shoeman RL, Thepaut M, Togashi T, Tono K, Yabashi M, Cammarata M, Foucar L, Bourgeois D, Sliwa M, Colletier JP, Schlichting I, Weik M. Nature Communications ; 11, 741

Parution de la nouvelle Lettre d’information de l’IBS

Retrouver le numéro de Février 2020.