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Institut de Biologie StructuraleGrenoble / France

Contacts relatifs à cet article / BOURGEOIS Dominique

Présentation

Responsable : Dominique Bourgeois

Présentation

L’équipe Pixel est une équipe multidisciplinaire travaillant à la frontière entre biologie structurale et cellulaire. L’équipe a été créée en 2010, répondant à l’évolution de la biologie structurale moderne vers une intégration dans le contexte cellulaire. L’équipe Pixel est fortement orientée vers la méthodologie et poursuit deux objectifs principaux :
1) Études mécanistiques et ingénierie des protéines fluorescentes
2) Développement de la microscopie de fluorescence super-résolution et application à des projets d’intérêt biologique principalement dans le domaine de la microbiologie et en collaboration avec d’autres équipes de l’IBS.
Notre thème central de recherche concerne l’étude photophysique des protéines fluorescentes dites « phototransformables » (PTFPs). Ces marqueurs fluorescents génétiquement encodés analogues à la GFP (Green Fluorescent Protein) sont fascinants car leur état de fluorescence peut être contrôlé par une illumination laser appropriée. Par exemple, la couleur d’émission de fluorescence de certaines PTFPs change du vert ou rouge suite à une illumination avec de la lumière violette. D’autres PTFPs peuvent être commutées irréversiblement d’un état « allumé » vers un état « éteint » en alternant des illuminations de couleur cyan et violette. Les PTFPs sont des acteurs fondamentaux pour la microscopie super-résolution ainsi que pour d’autres méthodes de fluorescence avancée comme le FRET (Fluorescence Resonance Energy Transfer) photochromique ou le stockage de données bioinspiré. Les propriétés de phototransformation comme la photoactivation, la photoconversion et la photocommutation doivent être comprises et optimisées pour chaque application. De plus, le « clignotement » (c’est-à-dire la perte transitoire de fluorescence) et le photoblanchiment (la perte irréversible de la fluorescence) sont des propriétés photophysiques cruciales qui concernent toutes les protéines fluorescentes et qui restent à ce jour mal caractérisées.
De nombreux groupes de recherches étudient et développent les protéines fluorescentes pour créer des marqueurs ou des senseurs toujours plus performants. Nous contribuons à ce champ de recherche en étudiant les PTFPs grâce à une palette d’outils très large : typiquement, nous employons une combinaison d’approches : cristallographie cinétique, spectroscopie in cristallo et, à travers des collaborations, modélisation. À ces approches in vitro et in silico, nous avons récemment ajouté des études in cellulo à l’échelle de la molécule unique.
Ces dernières années, nous avons largement focalisé notre attention vers les propriétés de photocommutation et de photoblanchiment des PTFPs. Alors que la photocommutation permet de très nombreuses applications fascinantes, le photoblanchiment constitue un des problèmes majeurs des protéines fluorescentes. Récemment, nous avons aussi commencé à étudier le phénomène de clignotement, créée par des processus assez mystérieux et ayant des conséquences néfastes pour les applications en microscopie super-résolution quantitative.
En parallèle avec ces études photophysiques, nous développons la microscopie super-résolution PALM, une méthode basée sur la localisation de molécules uniques, aujourd’hui utilisée très largement dans le monde pour dépasser la limite de diffraction. La technique PALM ne nécessite pas de microscope optique très sophistiqué, elle est entièrement basée sur la manipulation des propriétés photophysiques des PTFPs, ce qui donne sa cohérence à notre activité. Notre microscope PALM est aussi utilisé pour étudier les PTFPs in cellulo (ou in vitro) à l’échelle de la molécule unique. Dans l’équipe, nous nous intéressons aussi à des questions biologiques fondamentales dans le domaine de la microbiologie, en collaboration avec d’autres équipes de l’IBS. Par exemple nous travaillons à l’étude de la machinerie de division cellulaire chez Streptococcus pneumoniae (collaboration Thierry Vernet) , aux mécanismes de réparation de l’ADN chez Deinoccocus radiodurans (collaboration Joanna Timmins), aux mécanismes de la synthèse du sulfate d’heparan (collaboration Hughes Lortat Jacob), aux mécanismes de la reponse au stress Ldc-Rav chez E. coli (collaboration I. Gutsche) et au mécanisme d’efflux d’antibiotiques chez P. stuartii.
Un projet biologique impliquant l’imagerie super-résolution est mené au sein-même de l’équipe : il s’agit de la caractérisation de la machinerie de synthèse des sulfates d’héparane, dans l’appareil de Golgi de cellules mammifères. Ce projet est effectué en collaboration avec l’équipe SAGAG à l’IBS. Nous imageons en particulier quatre enzymes de cette machinerie, fusionnées à des protéines fluorescentes photoactivables et photoconvertibles. 

Collaborations

Collaborations externes :

- Georg-August-Université Göttingen, Allemagne
- Max Planck Institute for terrestrial microbiology Marburg, Allemagne
- University of Leuven, Belgique
- Goethe-Universität Frankfurt, Allemagne
- Bordeaux Imaging Center, France
- Université Paris XI, France
- i2BC-JOLIOT, Saclay, France

Collaborations internes (Super-resolution microscopy : biological projects) :
- groupe SAGAG (The heparan sulfate synthesis machinery , J. Beaudouin)
- équipe DNA Damage and Repair (Dynamique dans D. radiodurans, K. Floch)
- groupe Pneumococcus (Cell division and cell wall synthethis, C. Arthaud)
- équipe MMBV (E. coli stress response, C. Liesche ; Development of cryoCLEM, A. Burt)
- groupe IRPAS (The efferocytose synaptic machinery, P. Frachet)

Collaborations internes (Fluorescent proteins photophysics) :
- équipe Structural protein dynamics (M. Weik :
Fluorescent protein excited state dynamics studied by XFEL)
- Protein & RNA Folding and Methods development (Photophysics of PTFPs investigated by NMR, Nina Christou)

Personnel

Membres permanents :

- Dominique Bourgeois (CNRS - DR1)
- Virgile Adam (CNRS - CR1)
- Martin Byrdin (ingénieur - chercheur CEA, 30%)

Membres non-permanents :

- Joel Beaudouin

Étudiants en thèse :
- Daniel Thedie
- Kevin Floc’h (50% groupe VIC)
- Alister Burt (50% groupe MEM)
- Nina Christou (50% groupe NMR)

anciens Postdoctorants :
- Sergiy Avilov
- Delphine Arcizet

anciens thésards :
- Romain Berardozzi
- Chenxi Duan
- Aline Regis-Faro

Sujets de recherche abordés :

- Photophysique des protéins fluorescentes. Caractérisation des mécanismes de fluorescence. Mécanismes de photoactivation, photoconversion, photocommutation, clignotement et photoblanchiment. Mise au point de variants de protéines fluorescentes améliorées.
- Microscopie de superrésolution : PALM/TIR ; développements méthodologiques, nanoscopie contrôlée en température. Collaborations pour des applications en microbiologie.
- Dynamique des protéines photosensibles. Combinaison cristallographie cinétique, spectroscopie in cristallo et modélisation. Piégeage d’états intermédiaires.
- Applications biotechnologiques des protéines fluorescentes.

Mots-clés :

Protéines fluorescentes ; photophysique ; microscopie de fluorescence super-résolution ; microscopie TIRF ; imagerie de molécules uniques ; photoactivation ; photoconversion ; photocommutation, photoblanchiment ; microspectrophotométrie ; cristallographie cinétique ; dynamique structurale ; Dynamique des protéines et mécanismes ; Nanomachines macromoléculaires ; Développements méthodologiques ; Conception et ingénierie des protéines.

Techniques développées

- Microscopie de superrésolution : PhotoActivated Localization Microscopy (PALM) ; microscopie TIRF ; imagerie de molécules uniques.
- Spectroscopie optique : spectrophotométrie UV-visible et de fluorescence contrôlée en température
- Cristallographie cinétique : Combinaison de spectroscopie in cristallo et de cristallographie, piégeage d’intermédiaires réactionnels.
- Biologie cellulaire et moléculaire : ingénierie des protéines fluorescentes et construction de protéines de fusion

Faits marquants

- Structure d’Iris FP
- EosFP photoconversion
- IrisFP X blinking
- Padron cryoswitch
- IrisFP Vis blinking
- IrisFP photobleaching
- arg66
- rsFolder
- Iris FP SFX
- mEos2 dark states
- rsEGFP on-switching by XFEL