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Institut de Biologie StructuraleGrenoble / France

Contacts relatifs à cet article / BYRDIN Martin
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structure d’Iris FP

Un commutateur biologique au service de l’imagerie

Des chercheurs de l’Institut de Biologie Structurale Jean-Pierre Ebel (IBS, Institut mixte CEA-CNRS-Université Joseph Fourier, Grenoble) et de l’ESRF (European Synchrotron Radiation Facility, Grenoble), en collaboration avec des équipes allemandes et anglaises, viennent de développer une nouvelle protéine fluorescente dérivée de la GFP (green fluorescent protein). Cette protéine, Iris-FP, devrait permettre de suivre avec une très haute résolution la dynamique spatio-temporelle des protéines par microscopie. Ces résultats, qui apportent de nouvelles perspectives en nanoscopie et en biophotonique viennent d’être publiés en ligne par la revue Proceedings of the National Academy of Sciences (PNAS)

En plein essor ces dernières années, la nanoscopie regroupe l’ensemble des techniques de microscopie permettant d’obtenir une résolution spatiale de l’ordre de quelques dizaines de nanomètres. Une résolution bien supérieure à celle de la microscopi
e optique traditionnelle. Une de ces techniques est basée sur l’utilisation de nouvelles protéines fluorescentes dérivées de la protéine naturelle GFP, dont la fluorescence peut être modulée de façon contrôlée. Afin d’améliorer ce principe, de nombreuses équipes de biologie structurale tentent de développer de nouvelles protéines fluorescentes. Parmi ces nouvelles générations de protéines, certaines possèdent la propriété d’être photocommutables, c’est-à-dire qu’elles peuvent être « allumées » ou « éteintes » sur commande. D’autres, capables de photoconversion, ont la capacité de changer de couleur de façon contrôlée quand elles sont excitées par la lumière d’un laser. Dans cette étude récemment publiée par la revue PNAS, les chercheurs ont développé une nouvelle protéine, Iris-FP, qui présente la particularité de posséder ces deux propriétés. Le rayonnement X de l’ESRF leur a permis d’obtenir sa structure et d’en caractériser toutes les formes lumineuses.
Iris-FP est un marqueur très flexible et un outil qui va permettre d’améliorer encore les techniques de microscopie. En effet, fusionnée par génie génétique avec une protéine donnée, Iris-FP devrait permettre de faire un suivi dynamique très précis des mouvements de cette protéine dans la cellule, dans l’espace et au cours du temps.
Au-delà de leur utilisation en microscopie, le développement de ces nouvelles sondes fluorescentes ouvre de nouvelles perspectives dans le domaine des nanotechnologies. Des applications novatrices peuvent ainsi être envisagées comme, par exemple, la conception de mémoires de stockage basées sur le changement de couleur de cristaux de ces protéines. En perspective, la possibilité de stocker un nombre considérable d’informations dans des structures de taille nanométrique.

Virgile Adam, Mickaël Lelimousin, Susan Boehme, Guillaume Desfonds, Karin Nienhaus, Martin J. Field, Joerg Wiedenmann, Sean McSweeney, G. Ulrich Nienhaus, and Dominique Bourgeois. Structural characterization of IrisFP, an optical highlighter undergoing multiple photo-induced transformations. Proceedings of the National Academy of Sciences.(2008) 105:18343-8

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photoconversion d’EosFP

Un mécanisme complexe explique comment une protéine fluorescente change de couleur

Les protéines fluorescentes de la famille GFP sont extrêmement populaires car grâce à leur bioluminescence endogène, ce sont d’excellents marqueurs pour l’imagerie cellulaire. Ces dernières années de nouvelles protéines fluorescentes, dite "photoactivables", ont été développées, dont les propriétés de fluorescence changent en fonction des conditions selon lesquelles elles sont illuminées. Ces protéines fluorescentes photoactivables sont à la base de nouvelles méthodes d’imagerie de fluorescence "super-résolution", qui permettent d’obtenir des images de cellules vivantes avec une résolution nanomètrique. L’une des protéines photoactivables les plus utilisées en nanoscopie est la protéine EosFP. Cette protéine fluoresce normalement en vert, mais lorsqu’on l’illumine avec de la lumière violette, la fluorescence passe au rouge. Ce mécanisme de photo-conversion implique la cassure de la chaîne peptidique de la protéine à proximité immédiate du chromophore, ce qui résulte en une élongation du système conjugué. Mais l’origine de cette cassure n’était jusqu’à ce jour pas bien comprise. En utilisant des méthodes de simulation basées sur la recherche de chemins réactionnels à partir d’une modélisation de la protéine de type "QM/MM", et à partir des structures ristallographiques des états verts et rouges de EosFP, nous avons pu expliquer le mécanisme de photo-conversion. Lorsque la protéine absorbe un photon violet, elle passe dans un état excité "standard" de type singulet. Cependant, environ une fois sur 1000, cet état excité est converti dans un état "triplet", une transition normalement interdite. Dans cet état triplet, un mécanisme de transfert de proton peut avoir lieu, qui génère une cascade d’événements aboutissant finalement à la cassure de la liaison peptidique et à l’élongation du système conjugué. EosFP fluoresce alors en rouge. Ce travail est une avancée dans la connaissance des mécanismes des protéines fluorescentes photo activables, et permet d’envisager le
développement de variants améliorées.

Mickael Lelimousin, Virgile Adam, G. Ulrich Nienhaus, Dominique Bourgeois and Martin J. Field. Photoconversion of the Fluorescent Protein EosFP : A Hybrid Potential Simulation Study Reveals Intersystem Crossings. JACS (2009) 131:16814-23.

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IrisFP X blinking

Comment les protéines fluorescentes scintillent ?


Les protéines fluorescentes de la famille GFP sont des marqueurs remarquables pour l’imagerie cellulaire. Leur faible photo-stabilité, cependant, constitue leur principal défaut. Si l’on observe au microscope une molécule unique fluorescente (une protéine fluorescente, ou un chromophore organique par exemple), on s’aperçoit qu’elle scintille : la fluorescence n’est pas constante dans le temps, mais alterne entre des périodes "allumées" et des périodes "éteintes". Dans le cas des GFP, l’origine moléculaire et structurale de ce scintillement reste mystérieux. Des réactions à l’état excité peuvent générer une perte transitoire de fluorescence, comme le passage à l’état triplet, une protonation du chromophore, ou encore une isomérisation. Une autre possibilité consiste en un transfert d’électrons photo-induit, résultant en la production d’une espèce radicalaire instable et non fluorescente. Retour ligne automatique
Dans ce travail nous avons mis en évidence une telle espèce radicalaire, générée par les rayons X du Synchrotron Européen. En combinant cristallographie, spectroscopie Raman, et spectroscopie d’absorption et de fluorescence, nous avons pu montrer que l’état radicalaire s’accompagne d’une grande distorsion du chromophore, expliquant la perte de fluorescence. Il s’agit de la première étude montrant une protéine fluorescente dans un état transitoirement éteint. Cette étude pourrait permettre d’élaborer des variants dont la photo stabilité serait améliorée. Elle montre aussi l’importance des réactions de transfert d’électrons dans les protéines fluorescentes.

Adam V, Carpentier P, Violot S, Lelimousin M, Darnault C, Nienhaus GU, Bourgeois D. Structural Basis of X-ray-Induced Transient Photobleaching in a Photoactivatable Green Fluorescent Protein. J Am Chem Soc. (2009) 131:18063-5.

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Padron Cryoswitch

Une protéine fluorescente pour la cryonanoscopie

La microscopie de fluorescence super-résolution (ou « nanoscopie ») ouvre un champ de recherche considérable pour la biologie structurale intégrée. La nanoscopie "PALM" repose sur la photocommutation de protéines fluorescentes particulières, dites "photoactivables". Les mécanismes moléculaire de photocommutation sont liés à des changements conformationels importants du chromophore et de la matrice protéique, en général bloqués à basse température. Cependant, la mise au point d’une technique de nanoscopie à température cryogénique pourrait ouvrir la porte à des études corrélatives très fines avec la cryomicroscopie électronique. Il est donc important de trouver des marqueurs qui puissent commuter à basse température. Dans ce travail, nous avons étudié le mécanisme de photocommutation de la protéine fluorescente Padron, en combinant cristallographie, spectroscopie, et simulations par dynamique moléculaire. Nous avons découvert que Padron était capable de commuter à 100 K par isomérisation trans-cis de son chromophore, au sein d’une matrice protéique essentiellement rigide. Un changement conformationel d’une telle amplitude n’avait jamais été observé à une température si basse.

Regis-Faro, Aline ; Carpentier, Philippe ; Jonasson, Gabriella ; Pompidor, Guillaume ; Arcizet, Delphine ; Demachy, Isabelle ; Bourgeois, Dominique. "Low-temperature chromophore isomerization reveals the photoswitching mechanism of the fluorescent protein Padron." Journal of the American Chemical Society (2011) 133:16362-5.

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IrisFP Vis blink

Un nouvel éclairage sur les états « noirs » des protéines fluorescentes

Tous les marqueurs fluorescents utilisés en imagerie cellulaire « scintillent », alternant rapidement et de manière stochastique entre des états « allumés » (fluorescents) et des états « éteints » (non fluorescents). Dans le cas des protéines fluorescentes, l’origine de ce scintillement reste mystérieuse. Par une combinaison d’approches expérimentales (cristallographie/spectroscopie optique), nous avions montré en 2009 qu’un état transitoirement éteint de la protéine fluorescente IrisFP pouvait être induit par les rayons X, et s’accompagnait d’une distorsion de son chromophore (Adam et al, JACS, 2009, 131, 18063). Cependant, dans les conditions réelles d’imagerie, le scintillement résulte de l’illumination avec de la lumière visible, pas avec des rayons X. Dans l’étude présente, des simulations utilisant une approche hybride de type mécanique quantique/mécanique moléculaire (QM/MM) suggèrent que IrisFP peut scintiller de la même manière sous illuminations visible et X. La distorsion du chromophore à l’origine de l’intermittence de fluorescence s’explique par le transfert réversible d’un proton depuis une arginine voisine vers la partie centrale (pont méthylène) du chromophore dans un état triplet ou radicalaire. Cette distorsion du chromophore rompt momentanément sa conjugaison électronique et stoppe donc son émission de fluorescence. Ce travail est important pour la mise au point future de protéines fluorescentes plus photostables.Retour ligne manuel

Arijit Roy, Martin J. Field, Virgile Adam and Dominique Bourgeois. The Nature of Transient Dark States in a Photoactivatable Fluorescent Protein
JACS (2011) 133:18586-9

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IrisFP bleach

Comment meurent les protéines fluorescentes ?

Les protéines fluorescentes sont des marqueurs largement utilisés en imagerie cellulaire, constituant une boîte à outils extrêmement flexible pour étudier la cellule vivante. Malheureusement, contrairement aux colorants organiques, les protéines fluorescentes sont particulièrement sensibles au phénomène de photoblanchiment, qui se traduit par une extinction définitive de la fluorescence suite à une destruction photoinduite du chromophore. Le photoblanchiment est particulièrement problématique dans les techniques de microscopie super-résolution aujourd’hui en plein développement, limitant la précision des images pouvant être atteinte. En combinant cristallographie cinétique, spectroscopie optique et Raman, modélisation par dynamique moléculaire, spectrométrie de masse, et microscopie super-résolution, nous avons étudié les mécanismes photophysiques conduisant au photoblanchiment de la protéine fluorescente IrisFP. Nous avons montré qu’en fonction de l’intensité lumineuse utilisée pour l’expérience d’imagerie, deux mécanismes complètement différents se manifestent. À basse intensité laser, typique d’une expérience de microscopie standard en champ large, un mécanisme oxygène-dépendant domine. Au contraire, à haute intensité laser, typique des expériences de microscopie super-résolution, un mécanisme redox-dépendant devient prépondérant. Le premier mécanisme, susceptible de générer des espèces réactives de l’oxygène dans la cellule (ROS) serait donc plus cytotoxique que le deuxième mécanisme qui lui, n’en génère pas. Ainsi, ce travail suggère d’une manière contre-intuitive qu’en augmentant l’intensité laser, à dose constante, moins de dommages cellulaires seraient créés. Reste maintenant à vérifier si cette hypothèse se vérifie expérimentalement.

Chenxi Duan, Virgile Adam, Martin Byrdin, Jacqueline Ridard, Sylvie Kieffer-Jacquinot, Cécile Morlot, Delphine Arcizet, Isabelle Demachy & Dominique Bourgeois Structural Evidence for a Two-Regime Photobleaching Mechanism in a Reversibly Switchable Fluorescent Protein J. Am. Chem. Soc. (2013), 135 : 15841−15850

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arg66

Le côté obscur des protéines fluorescentes photoconvertibles

Les protéines fluorescentes photoconvertibles sont des marqueurs de choix pour la microscopie de fluorescence à super-résolution « PALM » (PhotoActivated Localization Microscopy). Ces marqueurs permettent notamment de compter une à une des protéines cibles d’intérêt, directement à l’intérieur de la cellule. Malheureusement, la justesse du comptage est limitée par le phénomène de « scintillement », i.e. le caractère discontinu de l’émission de lumière par une molécule fluorescente unique au cours du temps. En effet, un marqueur unique qui scintille ne peut pas être facilement différencié d’un ensemble de marqueurs distincts apparaissant successivement au même endroit. Le scintillement résulte de transitions stochastiques et réversibles entre états fluorescents et états sombres, mais les mécanismes en jeu restent très mal compris. L’amélioration de la qualité des analyses PALM quantitatives repose donc sur la conception de variants peu scintillants. En combinant cristallographie aux rayons X, spectroscopie et microscopie PALM, nous avons mis en évidence que l’orientation d’un seul aminoacide très conservé et situé à proximité du chromophore, contrôle entièrement le scintillement des protéines fluorescentes photoconvertibles. La connaissance de l’orientation de cet aminoacide (arginine 66) suffit alors pour prédire les propriétés de scintillement. Cette recherche (que l’ANR se refuse à financer) apporte donc de nouvelles connaissances en photophysique fondamentale et offre de nouvelles pistes pour la conception raisonnée de mutants optimisés pour la microscopie PALM quantitative.

Romain Berardozzi, Virgile Adam, Alexandre Martins & Dominique Bourgeois Arginine 66 Controls Dark-State Formation in Green-to-Red Photoconvertible Fluorescent Proteins Journal of the American Chemical Society 138, 558-565 (2016).

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rsFolder

Ouvrir la porte à la microscopie super-résolution dans les compartiments cellulaires oxydants

Divers compartiments cellulaires comme le réticulum endoplasmique ou l’espace intermembranaire mitochondrial peuvent être considérés comme des milieux « hostiles », car particulièrement oxydants. C’est aussi le cas du périplasme chez les bactéries, espace d’importance majeure pour la compréhension de la respiration cellulaire, la formation de biofilms ou la résistance aux antibiotiques. Lorsque des protéines d’intérêt sont fusionnées à des protéines fluorescentes pour permettre une observation microscopique, ces dernières une fois sécrétées dans ces environnements oxydants, sont en général incapables de se replier correctement et donc d’émettre de la fluorescence. Il existe cependant une exception notable, Superfolder-GFP, malheureusement inadaptée à la microscopie super résolution. Dans ce travail, en associant biochimie, cristallographie et études photophysiques, nous avons réalisé l’ingénierie rationnelle de Superfolder-GFP de façon à rendre ce marqueur photo-commutable. Pour cela, nous avons construit une protéine chimère combinant Superfolder-GFP et rsEGFP2, un dérivé de la GFP utilisable en super-résolution dans des environnements non-oxydants. Le résultat : rsFolder est un nouvel outil permettant l’observation de milieux aussi oxydants que le périplasme avec des résolutions de l’ordre de 70 nm. Le développement de rsFolder est actuellement poursuivi afin d’obtenir de nouvelles générations de marqueurs encore plus performants pour les biologistes et d’accéder à des territoires cellulaires hostiles non observables autrement à super-résolution.

El Khatib, M., Martins, A., Bourgeois, D., Colletier, J.-P. & Adam, V. Rational design of ultrastable and reversibly photoswitchable fluorescent proteins for super-resolution imaging of the bacterial periplasm. Scientific Reports 6, 18459 (2016).

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Iris FP SFX

Cristallographie sérielle de la protéine fluorescente commutable IrisFP

La cristallographie sérielle à l’échelle de la femtoseconde (SFX) est une nouvelle variante de la cristallographie qui exploite les impulsions très intenses produites par les lasers à électrons libres (XFEL) pour collecter des données de diffraction à partir de multiples micro ou nano cristaux. La nature ultra-courte de ces impulsions permet par ailleurs de caractériser la dynamique structurale avec une résolution de 100 femtosecondes. Une telle résolution est nécessaire pour comprendre certains événements complexes de la photochimie des protéines fluorescentes, par exemple comment s’opère la transition entre les états allumé et éteint des protéines photo-commutables. Ces protéines sont d’une importance majeure pour la microscopie de super-résolution.
Dans cette étude, le groupe DYNAMOP et ses collaborateurs de SACLA (Japon), du Max-Planck à Heidelberg, des Universités de Lille et Rennes et de l’ESRF, offrent une preuve de principe pour la conduite de ce type d’étude, en prenant comme protéine modèle la protéine fluorescente commutable IrisFP, développée à l’IBS. Grâce à la spectroscopie d’absorption ultrarapide, des états intermédiaires de photo-commutation ont été caractérisés de la picoseconde à milliseconde, qui suggèrent un processus séquentiel d’isomérisation et de transfert d’un proton. La structure SFX d’IrisFP, résolue à partir d’une quantité minimale d’échantillons (7µl de protéine cristallisée), montre un chromophore parfaitement défini, offrant le point de départ pour des expériences temps-résolu.

Serial Femtosecond Crystallography and Ultrafast Absorption Spectroscopy of the Photoswitchable Fluorescent Protein IrisFP. Colletier JP, Sliwa M, Gallat FX, Sugahara M, Guillon V, Schiro G, Coquelle N, Woodhouse J, Roux L, Gotthard G, Royant A, Uriarte LM, Ruckebusch C, Joti Y, Byrdin M, Mizohata E, Nango E, Tanaka T, Tono K, Yabashi M, Adam V, Cammarata M, Schlichting I, Bourgeois D, Weik M (2016) The Journal of Physical Chemistry Letters : 882-887

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