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Institut de Biologie StructuraleGrenoble / France

Contacts relatifs à cet article / ADAM Virgile
Contacts relatifs à cet article / BYRDIN Martin
Contacts relatifs à cet article / BOURGEOIS Dominique

microscopie sub-diffraction (PALM)

Une technique clé pour notre équipe est la déjà très réputée microscopie de localisation photoactivée (PhotoActivated Localization Microscopy, PALM). Grâce à cette méthode d’imagerie, inventée en 2006 [1-3] nous pouvons utiliser et caractériser les protéines fluorescentes phototransformables que nous développons pour les applications d’imagerie de fluorescence avancée. Le principe du PALM est de contourner la résolution optique limitée par la diffraction ( 200-300 nm de résolution) grâce à l’observation d’échantillons fortement marqués, quelques molécules à la fois. La photo-activation d’un nombre très limité de molécules individuelles par cliché acquis (généralement avec un temps d’exposition de quelques ms), permet leur localisation précise en raison de leur séparation spatiale. L’accumulation de milliers de ces clichés, chacun contenant un petit nombre de molécules uniques qui sont observées jusqu’à ce qu’elles photoblanchissent permettra la reconstruction d’une image super-résolue ( 20 nm de résolution).
Notre installation faite maison est équipée de cinq lasers continus (solid-state) dont les longueurs d’onde vont du violet au rouge et les intensités sont comprises entre 50 et 400 mW. Le flux de ces lasers est régulé par un filtre accordable acousto-optique (acousto-optical tunable filter, AOTF) piloté par ordinateur et une lampe blanche est également utilisable pour des longueurs d’onde spécifiques. Notre microscope motorisé inversé (Olympus IX81) est équipé de plusieurs objectifs aux grossissements allant de 5X à 100X, pouvant être couplés à un système anti-dérive "nose-piece" (Olympus). L’illumination de l’échantillon est rapidement commutable entre des modes grand champ direct et fluorescence de réflexion interne totale (TIRF). Un couplage par fibre optique est également disponible pour permettre à un spectrophotomètre d’obtenir une meilleure caractérisation spectrale des échantillons lors de l’acquisition d’images. Un système spécial de détection fait maison permet d’enregistrer des images avec deux caméras EMCCD (Photometrics Evolve 512) sur un à quatre canaux de couleur simultanément.

(A) Exemple de PALM sur une cellule humaine. Des fibres d’actine fusionnées à une protéine fluorescente photoconvertible du vert au rouge sont observées en microscopie conventionnelle à champ large (à gauche) et en PALM (à droite). Le zoom montre l’amélioration de la résolution optique. (B) La salle du microscope PALM et un zoom sur la table optique contenant notre montage.

[1] Betzig, E., et al., Imaging intracellular fluorescent proteins at nanometer resolution. Science, 2006. 313(5793) : 1642-5
[2] Rust, M.J., et al., Sub-diffraction-limit imaging by stochastic optical reconstruction microscopy (STORM). Nat Methods, 2006. 3(10) : 793-5
[3] Hess, S.T., et al., Ultra-high resolution imaging by fluorescence photoactivation localization microscopy. Biophys J, 2006. 91(11) : 4258-72

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spectroscopie optique

Spectroscopie d’absorption et de fluorescence d’échantillons microscopiques

Microspectrophotomètre Cryogenique d’Absorption/Luminescence CAL(AI)2DOSCOPE


Notre CAL(AI)2DOSCOPE est un appareil permettant l’enregistrement rapide and continu des spectres d’absorption et de luminescence en quasi-synchronie sur des zones exactement identiques d’échantillons microscopiques (nanolitres).

La spectroscopie optique est une méthode versatile pour la caractérisation de nouveaux matériaux, biologiques (protéines) ou non (colorants, nanomatériaux). Elle permet d’étudier d’une manière rapide et non-invasive leur pureté, leurs propriétés électroniques, certains paramètres physico-chimiques, leur stabilité par rapport aux solvants et à la température, etc.
Disposant généralement de quantités très limitées de substances à étudier, il y a une nécessité de miniaturisation de l’échantillon, - d’où le concept de microspectrophotométrie.
Dans un tel instrument, la totalité d’échantillon est illuminé à la fois, ce qui exclut le remplacement des molécules par diffusion. En cas d’illumination intense (comme c’est le cas avec des lasers), le matériau étudié peut alors se dégrader rapidement et il est vivement souhaitable d’étudier les processus d’absorption et de fluorescence avec un décalage minimal.
Concernant la biologie structurale, il existe dans le monde une poignée de microspectrophotomètres combinant absorption et fluorescence soit par une géométrie orthogonale des faisceaux, soit par commutation manuelle entre deux objectifs se faisant face. Par conséquent, ces appareils soit n’observent pas la même zone soit ils ne le font pas au même moment, soit ils ne font aucun des deux.
Notre montage est basé sur un arrangement colinéaire des chemins optiques des deux types de spectroscopies qui utilisent le même objectif et qui sont séparés par des miroirs semi-transparents et/ou dichroïques. Ce principe de construction permet d’empêcher un décalage entre les deux chemins.
La séparation des photons d’absorption et de fluorescence se fait par un basculement rapide entre les sources de lumière et les détecteurs respectifs grâce à un système d’obturateurs contrôlés par ordinateur. Ce système unique a donné son nom anglais à notre instrument :

Cryogenic Absorption/Luminescence Alignment Independent Alternative Illumination Detection Optical microSCOPE

Schème de principe de montage

Caractéristiques / Paramètres

* L’échange rapide entre des miroirs de différents rapports de réflexion / transmission permet d’adapter la distribution des photons entre les différents canaux

* La modularité et l’évolution sont aisées, grâce au couplage des sources de lumière et des détecteurs par des fibres optiques.

* Le montage de type “microscope” couplé à une caméra et le porte-échantillon goniométrique motorisé assurent une flexibilité maximale et une commodité dans la manipulation de l’échantillon et lors de l’alignement, la focalisation du faisceau et le changement d’objectif
.
* Les optiques (objectifs, miroirs, lames séparatrices, détecteurs) ont été optimisées pour une réponse spectrale très lisse dans l’UV/VIS (200-800 nm).

* Un cryostat d’azote gazeux permet de maintenir l’échantillon à des températures contrôlées entre 100 et 300 K.

* Selon le diamètre de la fibre optique utilisée (0,1 à 0,6 mm) et le grossissement de l’objectif (2x à 15x), des diamètres de tâches de 10 à 600 µm peuvent être réalisés, ce qui correspond à des volumes inférieurs au picolitre jusqu’à des volumes inférieurs au microlitre, respectivement.

* Pour la séparation d’excitation et d’émission de fluorescence, des miroirs dichroïques sont disponibles à 405, 488 et 561 nm.

* La résolution temporelle est limitée par l’obturateur et l’acquisition de la puce CCD à > 1 ms.

Applications

Le CAL(AI)2DOSCOPE permet la comparaison des cinétiques de vieillissement d’une protéine fluorescent par absorption et par fluorescence et d’obtenir d’indications pour distinguer la photo-déstruction transitoire (blinking) de celle qui est definitive (bleaching).

Flyer

en cliquant sur l’icone à droite, on peut télécharger un document sommaire décrivant l’instrument en format pdf

Presse

L’instrument a fait en 2016 l’objet d’un article dans le journal "spectroscopy europe"

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cristallographie cinétique

La cristallographie cinétique des protéines : une nouvelle approche pour visualiser les intermédiaires réactionnels à l’échelle quasi-atomique

La cristallographie cinétique consiste à déclencher la fonction biologique dans une protéine cristallisée, de manière à piéger des changements conformationels fonctionnels. La plupart des structures de protéines résolues par cristallographie aux rayons X correspondent à un état statique de la protéine qui ne représente pas bien l’ensemble des conformations adoptées en réalité par une protéine en action. La cristallographie cinétique des protéines permet d’investiguer la structure d’une manière dynamique. Voir Bourgeois & Weik, Crystallography Rev. (2009) 15,87-118 and Bourgeois & Royant, Curr. Opin. Struc. Biol. (2005) 15, 1-10).
Dans quelques cas très favorables (par exemple dans le cas de la myoglobine) des méthodes ultrarapides comme la diffraction de Laue permettent d’enregistrer des films en temps réel de protéines en action, avec une résolution temporelle approchant les 100 ps. Cependant, ces méthodes sont difficiles à appliquer. Dans un grand nombre de cas, il est alors possible d’utiliser une autre stratégie en piégeant des intermédiaires réactionnels dans le cristal dont les structures sont alors résolues en utilisant les techniques standard de collecte de données. (Pour un exemple dans l’équipe voir Katona et al, Science, (2007), 316, 449-52). Dans ce but, nous avons développé plusieurs instruments et approches méthodologiques fondés sur la photoactivation de chromophores endogènes ou exogènes, un contrôle précis de la température de l’échantillon, et le suivi de la réaction par spectroscopie in cristallo (absorption UV-visible et fluorescence, temps de vie de fluorescence et spectroscopie Raman). Nous appliquons ces techniques au cas des protéines fluorescentes qui sont particulièrement bien adaptées aux approches de cristallographie cinétique.


Mécanisme enzymatique de la superoxyde réductase de Desulfoarculus baarsii. Un résidu lysine importe une molécule d’eau essentielle pour la production de H2O2 dans le site actif de la SOR. (Katona et al., 2007)

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