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Institut de Biologie StructuraleGrenoble / France

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microscopie sub-diffraction (PALM)

Une technique clé pour notre équipe est la déjà très réputée microscopie de localisation photoactivée (PhotoActivated Localization Microscopy, PALM). Grâce à cette méthode d’imagerie, inventée en 2006 [1-3] nous pouvons utiliser et caractériser les protéines fluorescentes phototransformables que nous développons pour les applications d’imagerie de fluorescence avancée. Le principe du PALM est de contourner la résolution optique limitée par la diffraction ( 200-300 nm de résolution) grâce à l’observation d’échantillons fortement marqués, quelques molécules à la fois. La photo-activation d’un nombre très limité de molécules individuelles par cliché acquis (généralement avec un temps d’exposition de quelques ms), permet leur localisation précise en raison de leur séparation spatiale. L’accumulation de milliers de ces clichés, chacun contenant un petit nombre de molécules uniques qui sont observées jusqu’à ce qu’elles photoblanchissent permettra la reconstruction d’une image super-résolue ( 20 nm de résolution).
Notre installation faite maison est équipée de cinq lasers continus (solid-state) dont les longueurs d’onde vont du violet au rouge et les intensités sont comprises entre 50 et 400 mW. Le flux de ces lasers est régulé par un filtre accordable acousto-optique (acousto-optical tunable filter, AOTF) piloté par ordinateur et une lampe blanche est également utilisable pour des longueurs d’onde spécifiques. Notre microscope motorisé inversé (Olympus IX81) est équipé de plusieurs objectifs aux grossissements allant de 5X à 100X, pouvant être couplés à un système anti-dérive "nose-piece" (Olympus). L’illumination de l’échantillon est rapidement commutable entre des modes grand champ direct et fluorescence de réflexion interne totale (TIRF). Un couplage par fibre optique est également disponible pour permettre à un spectrophotomètre d’obtenir une meilleure caractérisation spectrale des échantillons lors de l’acquisition d’images. Un système spécial de détection fait maison permet d’enregistrer des images avec deux caméras EMCCD (Photometrics Evolve 512) sur un à quatre canaux de couleur simultanément.

(A) Exemple de PALM sur une cellule humaine. Des fibres d’actine fusionnées à une protéine fluorescente photoconvertible du vert au rouge sont observées en microscopie conventionnelle à champ large (à gauche) et en PALM (à droite). Le zoom montre l’amélioration de la résolution optique. (B) La salle du microscope PALM et un zoom sur la table optique contenant notre montage.

[1] Betzig, E., et al., Imaging intracellular fluorescent proteins at nanometer resolution. Science, 2006. 313(5793) : 1642-5
[2] Rust, M.J., et al., Sub-diffraction-limit imaging by stochastic optical reconstruction microscopy (STORM). Nat Methods, 2006. 3(10) : 793-5
[3] Hess, S.T., et al., Ultra-high resolution imaging by fluorescence photoactivation localization microscopy. Biophys J, 2006. 91(11) : 4258-72

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