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Institut de Biologie StructuraleGrenoble / France

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spectroscopie optique

Spectroscopie d’absorption et de fluorescence d’échantillons microscopiques


Microspectrophotomètre Cryogenique d’Absorption/Luminescence CAL(AI)2DOSCOPE


Notre CAL(AI)2DOSCOPE est un appareil permettant l’enregistrement rapide and continu des spectres d’absorption et de luminescence en quasi-synchronie sur des zones exactement identiques d’échantillons microscopiques (nanolitres).

La spectroscopie optique est une méthode versatile pour la caractérisation de nouveaux matériaux, biologiques (protéines) ou non (colorants, nanomatériaux). Elle permet d’étudier d’une manière rapide et non-invasive leur pureté, leurs propriétés électroniques, certains paramètres physico-chimiques, leur stabilité par rapport aux solvants et à la température, etc.
Disposant généralement de quantités très limitées de substances à étudier, il y a une nécessité de miniaturisation de l’échantillon, - d’où le concept de microspectrophotométrie.
Dans un tel instrument, la totalité d’échantillon est illuminé à la fois, ce qui exclut le remplacement des molécules par diffusion. En cas d’illumination intense (comme c’est le cas avec des lasers), le matériau étudié peut alors se dégrader rapidement et il est vivement souhaitable d’étudier les processus d’absorption et de fluorescence avec un décalage minimal.
Concernant la biologie structurale, il existe dans le monde une poignée de microspectrophotomètres combinant absorption et fluorescence soit par une géométrie orthogonale des faisceaux, soit par commutation manuelle entre deux objectifs se faisant face. Par conséquent, ces appareils soit n’observent pas la même zone soit ils ne le font pas au même moment, soit ils ne font aucun des deux.
Notre montage est basé sur un arrangement colinéaire des chemins optiques des deux types de spectroscopies qui utilisent le même objectif et qui sont séparés par des miroirs semi-transparents et/ou dichroïques. Ce principe de construction permet d’empêcher un décalage entre les deux chemins.
La séparation des photons d’absorption et de fluorescence se fait par un basculement rapide entre les sources de lumière et les détecteurs respectifs grâce à un système d’obturateurs contrôlés par ordinateur. Ce système unique a donné son nom anglais à notre instrument :

Cryogenic Absorption/Luminescence Alignment Independent Alternative Illumination Detection Optical microSCOPE

Schème de principe de montage

Caractéristiques / Paramètres

* L’échange rapide entre des miroirs de différents rapports de réflexion / transmission permet d’adapter la distribution des photons entre les différents canaux

* La modularité et l’évolution sont aisées, grâce au couplage des sources de lumière et des détecteurs par des fibres optiques.

* Le montage de type “microscope” couplé à une caméra et le porte-échantillon goniométrique motorisé assurent une flexibilité maximale et une commodité dans la manipulation de l’échantillon et lors de l’alignement, la focalisation du faisceau et le changement d’objectif
.
* Les optiques (objectifs, miroirs, lames séparatrices, détecteurs) ont été optimisées pour une réponse spectrale très lisse dans l’UV/VIS (200-800 nm).

* Un cryostat d’azote gazeux permet de maintenir l’échantillon à des températures contrôlées entre 100 et 300 K.

* Selon le diamètre de la fibre optique utilisée (0,1 à 0,6 mm) et le grossissement de l’objectif (2x à 15x), des diamètres de tâches de 10 à 600 µm peuvent être réalisés, ce qui correspond à des volumes inférieurs au picolitre jusqu’à des volumes inférieurs au microlitre, respectivement.

* Pour la séparation d’excitation et d’émission de fluorescence, des miroirs dichroïques sont disponibles à 405, 488 et 561 nm.

* La résolution temporelle est limitée par l’obturateur et l’acquisition de la puce CCD à > 1 ms.

Applications

Le CAL(AI)2DOSCOPE permet la comparaison des cinétiques de vieillissement d’une protéine fluorescent par absorption et par fluorescence et d’obtenir d’indications pour distinguer la photo-déstruction transitoire (blinking) de celle qui est definitive (bleaching).

Flyer

en cliquant sur l’icone à droite, on peut télécharger un document sommaire décrivant l’instrument en format pdf

Presse

L’instrument a fait en 2016 l’objet d’un article dans le journal "spectroscopy europe"

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