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Institut de Biologie StructuraleGrenoble / France

Contacts relatifs à cet article / SKOUFIAS Dimitrios

Les Kinésines

Eg5 : la kinésine impliquée dans la formation du fuseau bipolaire

Eg5 est une kinésine impliquée dans la bipolarisation du fuseau mitotique pendant les premiers stades de la division cellulaire (prophase). Son rôle, restreint à la division cellulaire et un arrêt mitotique très caractéristique (phénotype monoastral) observé lors de son inhibition (et qui peut amener à la mort cellulaire) a fait d’Eg5 la kinésine la plus étudiée comme cible thérapeutique contre des maladies comme le cancer. L’inhibiteur historique d’Eg5 est le monastrol. Après sa découverte, une série de petites molécules ont été testées sur Eg5 pour découvrir si elle en était aussi la cible et ainsi trouver d’éventuels candidats plus efficaces pour le dévelopement de nouveaux médicaments anti-cancéreux. Pour celà, des chimiothèques disponibles ont été utilisées au laboratoire et les candidats éventuels on été testés sur des cellules HeLa.

A la recherche de nouveaux inhibiteurs pour Eg5

Le criblage de la chimiothèque NCI avec Eg5 (environ 3000 molécules testées) a révélé 10 molécules qui inhibaient l’activité ATPasique in vitro, 5 qui ont provoqué le phénotype monoastral caractéristique pour l’inhibition d’Eg5 en cellules HeLa et seulement 1 d’entre elles qui était 36 fois plus active que le monastrol in vivo : la S-Trityl-L-cysteine (STLC) (1,2).

Après la découverte que Eg5 était une cible pour STLC, le type d’inhibition a été caractérisé suivant deux approches : une approche structurale et une approche enzymatique.

L’approche structurale (échange hydrogène/deuterium avec mutagénèse) a aidé à la détermination des zones de contacts entre STLC et Eg5 (3,4) et a démontré que l’inhibiteur se fixe dans la même région que le monastrol et qu’ il induit également une accomodation de la part d’Eg5 ("induced fit"). L’approche enzymatique a montré que STLC réalise une inhibition de type "tight binding", réversible et spécifique à Eg5. Dans les essais avec les cellules HeLa, STLC bloque la progression de la mitose (5). Cette molécule a une activité antitumorale démontrée, d’après les tests positifs obtenus sur 60 lignées cellulaires tumorales. Pour l’amélioration de son efficacité, des dérivés de STLC ont été obtenus par chimie combinatoire et ont également été testés (6,7).

Phénotype monoastral obtenu avec STLC
Figure 1 : Phénotype monoastral obtenu avec STLC (5).

Structure du domaine moteur d’Eg5 en complexe avec un dérivé du monastrol dans la forme (R)-énantiomère

Les structures tridimensionnelles du domaine moteur de la kinésine mitotique Eg5, ont été obtenues à 2.5 et 2.7 angstroms dans sa forme native et en complexe avec un inhibiteur dérivé du monastrol (mon-97), respectivement.Cette molécule a été obtenue par chimie combinatoire en collaboration avec les chimistes du Groupe de Chimie Combinatoire et Criblage à haut débit du CEA/Saclay. Cet inhibiteur provoque un arrêt mitotique lors d’essais sur des cellules HeLa et se trouve être plus actif que le monastrol, l’inhibiteur classique d’Eg5. Très curieusement, la structure montre que mon-97 se fixe sélectivement sur le domaine moteur dans sa conformation (R)-énantiomère (Figure 2), contrairement au monastrol, qui se fixe exclusivement dans sa forme (S). Un fait surprenant est que les deux formes (R)- et (S)- du mon-97 inhibent l’activité ATPasique d’Eg5 avec un IC50 de 110 nM et 520 nM (activité basale) et 150 nM et 650 nM (activité stimulée par les microtubules), respectivement. Néanmoins, ces différences sont suffisantes pour que la protéine sélectionne la forme (R) au dépens de la forme (S). Cette structure a ainsi montré que la conception rationnelle d’inhibiteurs basée sur la structure du monastrol devait tenir compte de la possibilité de deux énantiomères au lieu de restreindre la recherche des formes actives exclusivement à la forme (S) comme il était assumé auparavant (8).


Figure 2 : Structure 3-D du domaine moteur de Eg5 en complexe avec le (R)-mon-97 (en vert). Les résidus en contact avec l’inhibiteur sont indiqués en violet (8).


Figure 3 : Comparaison entre la structure A) avec (R)-mon-97 (8) et B) la structure avec le (S)-monastrol. A noter le mécanisme de "induced-fit" qui accommode les molécules dans le site de fixation.

Publications

1. DeBonis, S., Skoufias, D., Lebeau, L., Lopez, R., Robin, G., Margolis, R.L., Wade, R.H., Kozielski, F. (2004) In vitro screening for inhibitors of the human mitotic kinesin Eg5 with antimitotic and antitumor activities. Mol.Cancer Ther. 3, 1079-90

2. Kozielski, F., DeBonis, S., Skoufias, D.A. Chapter book : Methods in Molecular Medecine ; Microtubules Protocols, 2007 189-207

3. Brier, S., Lemaire, D., DeBonis, S., Forest, E., Kozielski, F. (2004). Identification of the protein binding region of S-trityl-L-cysteine, a new potent inhibitor of the mitotic kinesin Eg5. Biochemistry 43, 13072-82

4. Brier, S., Lemaire, D., DeBonis, S., Forest, E., Kozielski, F. (2006). Molecular dissection of the inhibitor binding pocket of mitotic kinesin Eg5 reveals mutants that confer resistance to antimitotic agents. J.Mol.Biol. 360, 360-76

5. Skoufias, D.A., DeBonis, S., Saoudi, Y., Lebeau, L., Crevel, I., Cross, R., Wade, R.H., Hackney, D., Kozielski, F. (2006) S-trityl-L-cysteine is a reversible, tight binding of the human kinesin Eg5 that specifically blocks mitotic progression. J. Mol. Biol. 281, 17559-69

6. Klein, E., DeBonis, S., Thiede, B., Skoufias, D.A., Kozielski, F., Lebeau, L. (2007). New chemical tools for investigating human mitotic kinesin Eg5. Bioorg. Med. Chem. 15, 6474-88

7. DeBonis, S., Skoufias, D.A., Indorato, R.-L., Liger, F., Marquet, B., Laggner, C., Joseph, B., Kozielski, F. (2007). SAR and docking investigations on a series of STLC analogues as inhibitors of the HsEg5. J.Med.Chem. In press.

8. Garcia-Saez, I., DeBonis, S., Lopez, R., Trucco, F., Rousseau, B. Thuéry, P., Kozielski, F. (2007). Structure of human Eg5 in complex with a new monastrol-based inhibitor bound in the R configuration. J. Biol. Chem. 282, 9740-7.

CENP-E : une kinésine associée au kinétochore

Le kinétochore humain est un assemblage supramoléculaire de protéines qui met en contact les chromosomes avec les microtubules du fuseau mitotique pour assurer une séparation précise des chromosomes lors de la division cellulaire. CENP-E (Centromere-Associated Protein E), un membre de la superfamille des kinésines, est un élément essentiel du kinétochore, puisqu’elle est requise pour la stabilisation de la liaison chromosomes-microtubules, pour la génération de tension sur les chromosomes alignés, pour la stabilisation des pôles du fuseau mitotique et pour satisfaire le "mitotic-checkpoint". La protéine complète (312 KDa) possède quatre domaines différents. Nous avons travaillé sur le domaine moteur N-terminal, incluant le domaine de fixation de l’ATP et une région de liaison aux microtubules.

Les cristaux du domaine moteur et région "linker" de CENP-E (Figure 1) ont été obtenus par cristallisation à haut-débit en utilisant le robot TECAN de la plateforme de cristallisation disponible au laboratoire. Les cristaux (737 x 132 x 79 µm) appartiennent au groupe d’espace P21 avec les paramètres de maille : a= 49.35Å, b= 83.70Å, c= 94.16Å et l’angle monoclinique ß = 103.05°.


Figure 1

On a obtenu la structure tridimensionnelle à 2.5Å de résolution, avec MgADP dans le site actif (Figure 2). La structure montre des différences subtiles par rapport à la kinésine humaine Eg5 et la kinésine conventionnelle. La région du "linker" est dans une position identique à celle de la kinésine humaine conventionnelle qui se déplace vers le pôle plus du microtubule. CENP-E est une cible anti-mitotique potentielle et cette structure pourrait servir de point de départ pour le criblage virtuel d’inhibiteurs potentiels.


Figure 2

La structure de CENP-E et la structure à résolution atomique de la tubuline ont été utilisées pour faire du "docking" dans des cartes obtenues par cryomicroscopie électronique pour étudier le mode d’interaction de cette kinésine avec les microtubules (Figure 3) (collaboration avec E. Neumann). L’interface CENP-E-microtubule a été aussi étudiée par des mesures d’échange hydrogène/deuterium en spectrométrie de masse (en collaboration avec S. Brier and D. Lemaire) avec l’utilisation du produit naturel marin Adociasulfate-2, un inhibiteur des kinésines qui est en compétion avec les microtubules. Cette molécule a été utilisée comme outil pour identifier la région d’interaction entre les microtubules et CENP-E, ainsi que pour Eg5.


Figure 3

Publications

1. Garcia-Saez, I., Blot, D., Kahn, R. & Kozielski, F. (2004). Crystallization and preliminary crystallographic analysis of the motor domain of human kinetochore-associated protein CENP-E, using an automated crystallization procedure. Acta Crystallogr. D Biol. Crystallogr. 60, 1158-60

2. Garcia-Saez, I., Yen, T., Wade, R.H. & Kozielski, F. (2004). Crystal structure of the motor domain of the human kinetochore protein CENP-E. J. Mol. Biol. 340, 1107-16

3. Demande de brevet d’invention en Europe. Patent n° 04 290 800.4. Deposition date : 25-3-2004 (CEA). Title : Crystal of kinetochore-Associated molecular motor protein CENP-E and their use for drug screening

4. Neumann, E., Garcia-Saez, I., DeBonis, S., Wade, R.H., Kozielski, F. and Conway, J.F. (2006). Human kinetochore-associated kinesin CENP-E visualized at 17 Å resolution bound to microtubules. J. Mol. Biol. 362, 203-11

5. Brier, S., Carletti, E., DeBonis, S., Hewat, E., Lemaire, D. and Kozielski, F. (2006). The marine natural product Adociasulfate-2 as a tool to identify the MT-binding region of kinesins. Biochemistry 45, 15644-53