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Institut de Biologie StructuraleGrenoble / France

Contacts relatifs à cet article / TIMMINS Joanna

La dynamique des processus de réparation de l’ADN

A. Réparation des cassures double-brin

La recombinaison homologue joue un rôle essentiel dans la réparation de divers lésions radio-induites de l’ADN, dont les cassures double-brin qui sont responsables de l’effet létal des rayonnements ionisants. Chez les bactéries, comme chez les eucaryotes, les mécanismes de réparation par recombinaison restent encore très flous. Bien que les protéines impliquées aient pour la plupart été identifié, le détail des événements menant de la reconnaissance des cassures double-brin à la recombinaison par RecA n’a pas encore été clairement établi.

Objectifs

Notre objectif est d’approfondir nos connaissances sur le rôle et la fonction de deux protéines essentielles impliquées dans la réparation par recombinaison chez D. radiodurans : RecN et RecR. Il a été proposé que RecN joue un rôle dans la reconnaissance des cassures double-brin, alors que RecR et ses partenaires dans la cellule (RecO et RecF) sont responsables du chargement de RecA sur les extensions simple brin de l’ADN avant la recombinaison homologue. Nous souhaitons étudier les divers complexes macromoléculaires formés par ces différents partenaires (ADN et protéines) en utilisant des techniques de cristallographie des protéines, de diffusion de Rayon X/Neutrons aux petits angles et d’imagerie de fluorescence sur molécules uniques.


La première structure quasi-atomique d’une protéine de type SMC (Structural Maintenance of Chromosomes), RecN, a été obtenue par l’assemblage de trois structures cristallines de fragments de RecN se chevauchant et par l’analyse de données de diffusion des rayons X aux petits angles mesurées sur la protéine intacte. Cette étude structurale complétée par une étude fonctionnelle de RecN nous a permis de proposer un modèle pour le rôle de RecN dans les premières étapes de réparation des cassures double-brin de l’ADN.

B. Réparation par Excision Nucléotidique

Le rayonnement ultra-violet constitue un danger permanent pour notre ADN et y introduit des lésions très diverses. Le NER est la principale voie de réparation pour ce type de lésions et implique une étape de reconnaissance de la lésion, suivie d’une étape d’excision. Chez les procaryotes, ce processus est effectué par les 4 protéines Uvr : UvrA, UvrB, UvrC et UvrD.

Objectifs

En collaboration avec l’équipe PIXEL de l’IBS, nous souhaitons utiliser la microscopie de super-résolution afin de localiser et de suivre les protéines Uvr individuellement dans leur environnement naturel, c’est-à-dire dans les cellules de Deinococcus radiodurans, avant et après avoir soumis ces cellules à des stress génotoxiques ou à des rayonnements UV. Pour atteindre cet objectif, nous utiliserons la technique PALM (photoactivated localization microscopy) pour prendre des images de cellules de D. radiodurans génétiquement modifiées exprimant les protéines Uvr en fusion avec des protéines fluorescentes.


A-B. Clichés de microscopie à fluorescence classique (haut) et de microscopie de super-résolution (bas) de Dendra2-UvrA1 (A) et mEosFP-M159A-UvrA1 (B) dans des cellules d’E. coli cells surexprimant D. radiodurans UvrA1 en fusion avec des proteins fluorescents (Dendra2 et mEOSFP-M159A). C. Exemples de clichés de microscopie classique (haut) et de super-résolution (bottom) de la protein HU associée avec le nucléoïde en fusion avec eYFP dans des cellules de C. crescentus. D. Clichés de microscopie électronique de cellules de D. radiodurans pris à l’IBS. La barre d’échelle correspond à 0.5µm pour A-C et à 0.2µm pour D.