Menu
Institut de Biologie StructuraleGrenoble / France

Contacts relatifs à cet article / BURMEISTER Wim

Équipe Burmeister

Responsable : Wim Burmeister

Nous travaillons sur la structure et la fonction des protéines virales, en particulier sur la machinerie de réplication de l’ADN du virus de la vaccine en combinant biologie structurale (cristallographie aux rayons X, microscopie électronique, diffusion des rayons X aux petits angles) et techniques biophysiques (MALLS, résonance plasmonique de surface, anisotropie par fluorescence) avec des techniques biochimiques.
L’une des grandes réussites de la médecine moderne a été l’éradication du virus de la variole déclarée en 1979 après une longue campagne de vaccination par le virus de la vaccine. Après les attentats terroristes de 2001, un nouvel intérêt pour les poxvirus s’est manifesté dans le contexte d’une utilisation potentielle par le bioterrorisme. Enfin, avec une couverture vaccinale quasi inexistante de la population humaine, le principal risque aujourd’hui est l’introduction d’un orthopoxvirus dans la population humaine à partir d’un réservoir animal. Il est devenu évident que les poxvirus circulent largement au niveau des animaux de ferme et des rongeurs sauvages. Récemment, plusieurs maladies à risque épidémique sont apparues après l’introduction d’un virus provenant d’un réservoir animal (VIH, SRAS, grippe aviaire, virus Ebola). Il semble donc essentiel de se préparer aux infections à poxvirus par la disponibilité d’un panel d’antiviraux ; mais, à ce jour, il n’existe que deux molécules, le brincidofovir et le tecovirimat. Une meilleure connaissance de la structure des protéines des poxvirus en général et de la polymérase en particulier permettra de développer de nouveaux composés et de mieux comprendre les mécanismes de résistance aux molécules actuelles. Nous travaillons sur le virus de la vaccine qui est identique à 98 % au virus de la variole au niveau des acides aminés des protéines de réplication.
Nous nous concentrons sur les protéines de réplication essentielles, l’hélicase-primase D5, l’ADN polymérase composée de la sous-unité catalytique E9 et le facteur de processivité composé de la protéine accessoire A20 et de l’uracile N-glycosylase D4, dont la capacité de liaison avec l’ADN est utilisée. Au cours des dernières années, nous avons obtenu des informations sur la structure tridimensionnelle de ces protéines à résolution croissante qui remplissent progressivement notre enveloppe initiale à basse résolution (Figure 1,[6]).

Figure 1 : Modèle du complexe de l’holoenzyme de la polymérase. L’enveloppe a été obtenue par SAXS [6]. Les structures à haute résolution disponibles ont été positionnées. L’ADN lié à la polymérase a pu être modélisé [1] alors que l’ADN lié à D4 a été observé dans la structure d’un complexe [5]. L’organisation globale de la fourchette de réplication reste inconnue.

En raison de sa dynamique et de sa flexibilité, la structure à haute résolution de l’hélicase-primase D5 est est restée inaccessible. Nous avons obtenus des informations a basse information sur la structure et l’organisation en domaines [2]. D5 est étroitement apparenté à l’hélicase Lta du polyomavirus. La protéine a fait l’objet d’études approfondies par diffusion de rayons X à petit angle (SAXS), ce qui a conduit à de nouveaux développements méthodologiques. Avec l’évolution rapide de la cryo-microscopie électronique à l’IBS, nous espérons être en mesure d’obtenir de nouvelles informations fonctionnelles et structurelles dans un avenir proche.
En revanche, nous avons obtenu une percée avec la structure à 2,7 Å de la sous-unité catalytique E9 de la polymérase (Figure 2,[1]).

Figure 2 : Organisation des domaines de la polymérase E9

Sur la base de ces résultats, nous travaillons sur la fonction du mécanisme de réplication qui réplique la structure unique de l’ADN du génome du poxvirus qui consiste en un ADN double brin linéaire qui est circularisé aux extrémités. La connaissance détaillée des interfaces des différentes sous-unités de la polymérase sera utilisée pour la conception d’inhibiteurs qui interfèrent avec l’assemblage du complexe protéique. Cet aspect est développé dans le cadre d’un projet financé par la FRM (Fondation de Recherche Médicale) sur l’optimisation des peptides visant à perturber les surfaces d’interaction des protéines des machines de réplication. En particulier, l’interface entre la sous-unité D4 uracile-ADN-N-glycosylase et la protéine A20 du facteur de processivité sera cibléecar elle a déjà été étudiée en profondeur (Figure 3,[3,5]).

Figure 3 : Vue d’une partie de l’interface entre un fragment d’A20 (pink) et D4 (D4) avec une partie de sa densité électronique

This project is based on a collaboration with Frederic Iseni who directs the Laboratory of Virology at the IRBA, Bretigny-sur-Orge in the Paris area.

Mots clés

poxvirus, réplication d’ADN, polymérase d’ADN, hélicase, primase, facteur de processivité

Techniques spécialisées

Production de protéines recombinantes dans les cellules d’insectes et E. coli
- Cristallographie aux rayons X
- Caractérisation biochimique et biophysique (anisotropie par fluorescence, résonance plasmonique de surface, SAXS, dichroïsme circulaire, MALLS)
- Microscopie électronique en collaboration avec le groupe Microscopie électronique et méthodes.

Membres de l’équipe

• Wim Burmeister, Professeur
• Nicolas Tarbouriech, Maître de conférence

Publications principales

[1] Tarbouriech N, Ducournau C, Hutin S, Mas PJ, Man P, Forest E, Hart DJ, Peyrefitte CN, Burmeister WP, Iseni F. The vaccinia virus DNA polymerase structure provides insights into the mode of processivity factor binding. Nat Commun 8:1455 (2017). link.

[2] Hutin, S., Ling, W. L., Round, A., Effantin, G., Reich, S., Iseni, F., Tarbouriech, N., Schoehn, G. & Burmeister, W. P. Domain organization of vaccinia virus helicase-primase D5. J. Virol. 90, 4604-13. doi : 10.1128/JVI.00044-16. (2016). link

[3] Contesto-Richefeu, C., Tarbouriech, N., Brazzolotto, X., Burmeister, W.P., Peyrefitte, C.N. & Iseni, F. Structural analysis of point mutations at the Vaccinia virus A20/D4 interface. Acta Cryst. F72, doi:10.1107/S2053230X16011778 (2015). link

[4] Thierry, E., Brennich M., Round, A., Buisson M., Burmeister, W. P. & Hutin, S. Production and characterization of Epstein-Barr virus helicase primase complex and its accessory protein BBLF2/3. Virus Genes. doi 10.1007/s11262-015-1233-6 (2015). link

[5] Burmeister, W.P., Tarbouriech, N., Fender, P., Contesto-Richefeu, C., Peyrefitte, C.N. & Iseni, F. Crystal structure of the vaccinia virus uracil DNA-glycosylase in complex with DNA. J Biol. Chem. pii : jbc.M115.648352. (2015). link

[6] Sèle, C., Gabel, F., Gutsche, I., Ivanov, I., Burmeister, W.P., Iseni, F. & Tarbouriech, N. Low-Resolution Structure of the Vaccinia Virus DNA Replication machinery. J. Virol. 87 : 1679-1689 (2012). link