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Institut de Biologie StructuraleGrenoble / France

Contacts relatifs à cet article / CONTRERAS-MARTEL Carlos

Les facteurs de virulence et les systèmes de sécrétion

Mécanisme d’assemblage du système de sécrétion de type 2 (SST2)

Le système de sécrétion de type 2 est impliqué dans les processus d’infection, de colonisation et de communication microbienne. Un élément important dans ces types de systèmes est la sécrétine, une protéine membranaire qui forme un pore au niveau de la surface bactérienne, permettant aux toxines d’être sécrétées dans l’environnement. Nous avons utilisé des techniques de microscopie électronique, de cristallographie et de génétique microbienne en collaboration avec le groupe MEM de l’IBS et l’université de Saskatchewan au Canada afin de résoudre la structure (à environ 3.5 Å de résolution) de deux sécrétines issues des pathogènes émergents Vibrio vulnificus et Aeromonas hydrophila ; nous avons également caractérisé leur mécanisme d’assemblage sur la membrane bactérienne. Ce travail montre que l’assemblage de certaines sécrétines requièrent l’assistance de lipoprotéines membranaires appelées « pilotines » alors que d’autres sont assemblées de façon indépendante. Puisque l’interface sécrétine-pilotine est essentielle pour la virulence de nombreux pathogènes, elle pourrait être une cible originale pour le développement de nouveaux inhibiteurs contre les infections par différentes bactéries.

Howard SP, Estrozi L, Contreras-Martel C, Bertrand Q, Job V, Martins A, Schoehn G, Dessen A. (2018) Structure and assembly of pilotin-dependent and -independent secretins of the Type II secretion system. PLoS Pathogens ; 15(5):e1007731

Protéines architecturales : sécrétines


Tosi T, Estrozi LF, Job V, Guilvout I, Pugsley AP, Schoehn G, Dessen A. (2014) Structural similarity of secretins from type II and type III secretion systems. Structure 22, 1348-1355.

Le composant de la membrane externe du SST2 et du SST3 est la sécrétine, une protéine formant un canal d’homo-multimères en forme d’anneaux qui permet l’assemblage de l’aiguille et la sécrétion des toxines et des hydrolases. Notre groupe, en étroite collaboration avec le groupe de microscopie électronique dirigé par G. Schoehn à l’IBS, a récemment caractérisé structuralement les sécrétines PulD du SST2 de Klebsiella oxytoca et PscC du SST3 de Pseudomonas aeruginosa. Pour cela, les 2 sécrétines ont été produites en système Cell-free et l’analyse de particules uniques a été faite par cryo-microscopie électronique. Les 2 structures présentent une architecture du type « tasse et soucoupe ». Ces structures nous révèlent des détails internes tels que la présence d’une cavité au niveau de l’anneau formant la "soucoupe" (ce qui n’a pas jamais été observé auparavant), ainsi qu’un connecteur central et un réseau périplasmique, indiquant que la partie C-terminale des sécrétines est constituée d’éléments structurés pouvant adopter différentes conformations dans la membrane.

Fig. 2.- Reconstruction tridimensionnelle par cryo-EM de la partie ancrée dans la membrane de PscC de P. aeruginosa. La vue de dessus, de côté et de dessous sont montrées à 1.3 sigma.

Fig. 3.- Vue en coupe de PscC. La densité de la tranche sagittale montre une cavité au sein de l’anneau externe de la sécrétine et mesurant approximativement 70 Å, ainsi qu’un connecteur central et un rétrécissement au niveau du périplasme.

Les bactéries ont-elles un système immunitaire ?

Wong, SG and Dessen, A. (2014) Structure of a bacterial alpha-2-macroglobulin reveals mimicry of eukaryotic innate immunity. Nature Comm. 5, 4917

Les Alpha-2-macroglobulines (A2Ms) sont des protéines plasmiques capables de piéger et d’inhiber une large gamme de protéases et font partie des composants majeurs du système immunitaire eucaryote. Étonnamment, des protéines de type A2M ont été identifiées chez des bactéries pathogènes invasives et chez des espèces colonisant des eucaryotes supérieurs. Les A2Ms bactériennes sont localisées dans le périplasme où elles sont censées assurer la protection de la cellule en piégeant des protéases externes grâce à une interaction covalente avec une fonction thioester activée. Ce travail montre les structures cristallines et la caractérisation de l’A2M de Salmonella enterica ser. Typhimurium (Sa-A2M) dans différents états d’activation de la fonction thioester. Ces structures révèlent treize domaines dont l’arrangement présente une forte similarité avec des protéines impliquées dans la défense immunitaire eucaryote. Un mécanisme structural de verrouillage permet de maintenir la fonction thioester enfouie stable, ceci étant nécessaire pour son activité de piège à protéase. Ces résultats indiquent que les bactéries ont développé un système immunitaire inné rudimentaire qui imite le mécanisme du système des eucaryotes.

Collaborateurs : I. Attree, iRTSV Grenoble ; G. Schoehn, IBS Grenoble

Toxines : ExoU

Gendrin C, Contreras-Martel C, Bouillot S, Elsen S, Lemaire D, Skoufias DA, Huber P, Attree I, Dessen A. (2012) Structural basis of cytotoxicity mediated by the type III secretion toxin ExoU from Pseudomonas aeruginosa. PLoS Pathog. e1002637.

ExoU est la toxine la plus préjudiciable injectée par le SST3 de P. aeruginosa. ExoU est exprimée par environ 30% des souches cliniques, dont 90% causent des infections aigues. Son gène est codé dans un îlot de pathogénicité avec sa chaperonne SpcU, elle-même nécessaire pour la bonne sécrétion de ExoU dans le cytoplasme bactérien. ExoU est une protéine de 687 résidus qui, une fois transportée à travers le SST3, induit des effets cytotoxiques conduisant à une rapide mort cellulaire par nécrose ; Les souches KO-ExoU de P. aeruginosa présentent une virulence nettement diminuée dans les modèles d’infection aiguë chez les souris. Dans les milieux cliniques, les souches de P. aeruginosa exprimant ExoU conduisent à un mauvais pronostic du patient, puisque la toxine provoque des lésions épithéliales aigues du poumon et est liée au développement de chocs septiques.

Notre travail a permis la résolution de la structure cristalline de ExoU en complexe 1 : 1 avec sa chaperonne, SpcU. ExoU est repliée en trois domaines distincts, qui remplissent les fonctions de catalyse, de pontage et de liaison à la membrane (Fig. 4). ExoU est une phospholipase, dont le site actif enfoui adopte un repliement alpha/beta hydrolase dans une fente protégée par des boucles flexibles.

Fig.4.- ExoU est repliée en trois domaines interconnectés. SpcU, sa chaperone cytosolique (en vert) enserre le premier brin beta d’ExoU afin de compléter son 6ième feuillet beta.
Après translocation dans le cytoplasme eucaryote, ExoU se lie à la membrane plasmique où elle est ubiquitinylée au niveau de sa Lys178. Nous avons montré par complémentation de fluorescence bimoléculaire avec la protéine fluorescente Venus (Fig. 5) que Ub-ExoU n’est pas seulement localisée au niveau de la membrane plasmique, mais qu’elle colocalise également avec des marqueurs de l’endocytose (Fig. 6) :

Fig.5.- Des cellules HeLa transfectées avec des clones exprimant l’Ubiquitine et ExoU clonés en amont et en aval des domaines N- et C-terminaux de la protéine fluorescente Venus révèlent de la fluorescence au niveau de la membrane cellulaire mais aussi dans la cellule.

Malgré les efforts de la cellule pour détruire ExoU en l’adressant aux lysosomes, elle meurt rapidement puisque ses bicouches sont endommagées par l’activité phospholipase puissante de ExoU.

Fig.6.- ExoU colocalise avec des marqueurs caractéristiques de l’endocytose tels que EEA1 (early endosome antigen 1) et lysotracker red (marqueur lysosomal).