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Institut de Biologie StructuraleGrenoble / France

Contacts relatifs à cet article / CONTRERAS-MARTEL Carlos

Architecture et sécrétion des toxines

Collaborateurs : I. Attree, iRTSV Grenoble ; G. Schoehn, IBS Grenoble

La bactérie possède plusieurs systèmes de sécrétions ayant pour rôle le transport de toxines et d’effecteurs du cytoplasme vers le milieu extérieur ou vers le cytoplasme d’une cellule cible. Le système de sécrétion de type II (SST2) consiste en un assemblage dynamique de 12-15 protéines qui permet notamment la sécrétion d’holo-toxines multipartites et d’hydrolases telle que la pullulanase, à travers la membrane externe et dans leur état replié. Le système de sécrétion de type III (SST3) possède une base ancrée dans la membrane ainsi qu’une aiguille creuse formée d’une seule protéine polymérisée, par laquelle des effecteurs, capables de manipuler les fonctions de l’hôte, sont transloqués directement dans le cytoplasme de la cellule cible.

Fig.1.- Schéma du système de sécrétion de type III de Pseudomonas aeruginosa où sont repésentées les structures résolues par notre groupe. (from Izoré, Job, and Dessen (2014) Structure 19, 603-612). Movie

Protéines architecturales : sécrétines

Tosi T, Estrozi LF, Job V, Guilvout I, Pugsley AP, Schoehn G, Dessen A. (2014) Structural similarity of secretins from type II and type III secretion systems. Structure 22, 1348-1355.

Le composant de la membrane externe du SST2 et du SST3 est la sécrétine, une protéine formant un canal d’homo-multimères annulaires pour l’assemblage de l’aiguille et la sécrétion des toxines et des hydrolases. Notre groupe, en étroite collaboration avec le groupe de microscopie électronique dirigé par G. Schoehn à l’IBS, a récemment fait la caractérisation structurale des sécrétines PulD du SST2 de Klebsiella oxytoca et PscC du SST3 de Pseudomonas aeruginosa. Pour cela, les 2 sécrétines ont été produites en système Cell-free et l’analyse de particules uniques a été faite par cryo-microscopie électronique. Les 2 structures présentent une architecture type « tasse et soucoupe ». Ces structures nous révèlent des détails internes tels qu’une cavité au niveau de l’anneau formant la"soucoupe" (ce qui n’a pas été observé dans les structures déjà publiées), ainsi qu’un connecteur central et un réseau périplasmique, indiquant que la partie C-terminale des sécrétines sont constitués d’éléments structurés pouvant adopter différentes conformations dans la membrane.

Fig. 2.- Reconstruction tridimensionnelle par cryo-EM de la partie ancrée dans la membrane de PscC de P. aeruginosa. La vue de dessus, de côté et de dessous sont montrées à 1.3 sigma.

Fig. 3.- Vue en coupe de PscC. La densité de la tranche sagittale montre une cavité au sein de l’anneau externe de la sécrétine et mesurant approximativement 70 Å, ainsi qu’un connecteur central et un rétrécissement au niveau du périplasme.

Toxines : ExoU

Gendrin C, Contreras-Martel C, Bouillot S, Elsen S, Lemaire D, Skoufias DA, Huber P, Attree I, Dessen A (2012) Structural basis of cytotoxicity mediated by the type III secretion toxin ExoU from Pseudomonas aeruginosa. PLoS Pathog. e1002637.

ExoU est la toxine injectée par le SST3 P. aeruginosa la plus préjudiciable. ExoU est exprimée par environ 30% des souches cliniques, 90% causant des infections aigues. Son gène est encodé sur un îlot de pathogénicité avec sa chaperonne SPCU, qui est nécessaire pour la bonne sécrétion de ExoU dans le cytoplasme bactérien. ExoU est une protéine de 687 résidus qui, une fois transportée à travers le SST3, induit des effets cytotoxiques conduisant à la mort cellulaire nécrotique rapide ; Les souches KO-ExoU de P. aeruginosa présentent une virulence nettement diminuée dans des modèles murins d’infection aiguë. Dans les milieux cliniques, les souches de P. aeruginosa exprimant ExoU conduisent à un mauvais pronostic du patient, puisque la toxine provoque des lésions épithéliales aigues du poumon et est liée au développement de chocs septiques.

Notre travail a permit la résolution de la structure cristalline de ExoU en complexe 1 : 1 avec sa chaperone, SPCU. ExoU est repliée en trois domaines distincts, qui remplissent la fonction catalytique de pontage et la fonction de liaison à la membrane (Fig. 4). ExoU est une phospholipase, ainsi son site actif enfoui adopte un repliement a/b hydrolase dans une fente protégée par des boucles flexibles.

Fig.4.- ExoU est repliée en trois domaines interconnectés. SpcU, sa chaperone cytosolique (en vert) enserre le premier brin Beta d’ExoU afin de compléter son 6ième feuillet Beta.
Après translocation dans le cytoplasme eucaryote, ExoU se lie à la membrane plasmique où elle est ubiquitinylée au niveau de sa Lys178. Nous avons montré par complémentation de fluorescence bimoléculaire avec la protéine fluorescente Venus (Fig. 5) que Ub-ExoU n’est pas seulement localisée au niveau de la membrane plasmique, et qu’elle colocalise avec des marqueurs de la voie d’endocytose (Fig. 6) :

Fig.5.- Des cellules HeLa transfectées avec des clones exprimant l’Ubiquitine et ExoU clonés en amont et en aval des domaines N- et C-terminal de la protéine fluorescente Venus révèlent de la fluorescence au niveau de la membrane cellulaire mais aussi dans la cellule.

Malgré les efforts de la cellule pour détruire ExoU en l’adressant à ses lysosomes, elle meurt rapidement puisque ses bicouches sont endommagées par l’activité phospholipase puissante de ExoU

Fig.6.- ExoU colocalise avec des marqueurs caractéristiques du système d’endocytose tels que EEA1 (early endosome antigen 1) et lysotracker red (marqueur lysosomal).