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Institut de Biologie StructuraleGrenoble / France

Contacts relatifs à cet article / DI GUILMI Anne-Marie / DURMORT Claire / MORLOT Cécile / ZAPUN André

Métabolisme de la paroi cellulaire et morphogenèse

Nos travaux passés sur les mécanismes de résistance aux beta-lactamines nous ont amené à étudier plus généralement le métabolisme de la paroi cellulaire du pneumocoque. L’assemblage du peptidoglcyane, le constituant majeur de la paroi, est catalysé par les PBPs (« Penicillin-Binding Proteins ») qui sont les cibles des beta-lactamines. La réaction des PBPs avec les beta-lactamines est bien connu, ainsi que les mécanismes de résistance à ces molécules (Zapun et al. 2008, collab. Groupe Pathogénie bactérienne).

Paradoxalement, les réactions physiologiques de synthèse du peptidoglycane catalysées par les PBPs sont mal caractérisées. Comprendre comment les PBPs, qui sont altérées sous la pression de sélection des antibiotiques, restent fonctionnelles pour la synthèse de la paroi devrait nous aider à combattre les résistances. Les fonctions physiologiques précises des divers PBPs et les conséquences de leur inactivation par les beta-lactamines restent également largement ignorées. Les rôles et les substrats particuliers des diverses hydrolases du peptidoglycane sont aussi très mal connus. Pour attaquer ces problèmes, nous combinons des approches biochimiques in vitro avec des expérience de génétique in vivo et des études de localisation des protéines utilisant des techniques avancées de microscopie.

Nous avons reproduit avec succès in vitro la synthèse du peptidoglycane de pneumocoque (Zapun et al. 20133, collab. E. Breuking (NL) and D. Roper (UK)). Notre essai utilise un précurseur fluorescent du peptidoglycane et les produits sont observés par électrophorèse en gel. Nous étudions actuellement in vitro comment des PBPs altérés provenant de souches résistantes cliniques assemblent le peptidoglycane, bien qu’ils ne réagissent pas avec les beta-lactamines qui imitent le substrat naturel.
De façon cruciale, le précurseur de l’assemblage du peptidoglycane, le lipide II, doit être converti en une form utilisable par les PBPs du pneumocoque par l’amidation du second résidu de la partie peptidique (Zapun et al. 2013). Cette conversion est effectuée par l’amidotransférase MurT/GatD, que nous caractérisons en détails.

[bleu marine]Assemblage du peptidoglycane à la surface cellulaire du pneumocoque par les PBPs (vert et jaune).[/bleu marine]

L’intégrité de la paroi dépend de l’équilibre délicat entre les activités synthétiques et hydrolytiques. Des hydrolases sont nécessaires pour la séparation des cellules, mais également pour permettre l’insertion de nouveau peptidoglycane dans la paroi préexistante. Nous étudions actuellement les fonctions de LytA et Pmp23, par des approches génétiques, biochimiques et de localisation.
LytA est une amidase requise pour l’autolyse du pneumocoque en phase stationnaire. Le mécanisme de son recrutement à la surface est particulièrement intéressant car LytA ne possède pas de séquence signal de sécretion. Pmp23 est possiblement une transglycosylase lytique qui joue un rôle dans la morphogenèse et l’organisation de l’assemblage de la paroi.

[bleu marine]Localisation de l’hydrolase du peptidoglycane LytA à la surface du pneumocoque.[/bleu marine]

La paroi définit la forme de la cellule bactérienne. La régulation de l’assemblage de la paroi et son hydrolyse est donc essentielle pour comprendre la morphogenèse bactérienne.
La fonction exacte des différents PBPs dans la construction d’une paroi de forme correcte reste en partie mystérieuse. Une étude de l’effet de l’inhibition de PBP2x et PBP2b avec une beta-lactamine spécifique à permis de proposer une révision du model de la formation de la paroi chez le pneumocoque (Philippe et al. 2015).
Parmi les PBPs du pneumocoque, PBP2x partage des modules structuraux avec la serine/thréonine kinase de type eucaryote StkP, qui joue un rôle dans la morphogenèse. Nous avons montré que les deux protéines interagissent et nous poursuivons l’étude de leur fonction respectives (Morlot et al. 2013, collab. C. Grangeasse, BMSSI, Lyon).

[bleu marine]Localisation de PBP2x (fusioné à la GFP) dans une souche sauvage (gauche) et dans différentes lignées mutantes dans le gène codant StkP (centre et droite).[/bleu marine]

La protéine de type tubuline du cytosquelette bactérien FtsZ est considérée comme l’organisateur principal de la division cellulaire. FtsZ form un anneau au site de division du côté cytoplasmique de la membrane et recrute les autres protéines requises pour la division, dont celles impliquées dans le métabolisme de la paroi. Pour étudier plus en détail les rapports entre l’assemblage de la paroi et la division, nous avons développé et appliqué la microscopie super-résolue au pnaumocoque (avec l’équipe PIXEL, D. Bourgeois, IBS). La technique PALM (« photo-activated light microscopy ») a été utilisée pour localiser FtsZ fusionné à une protéine fluorescente durant le cycle cellulaire de plusieurs mutants.

[bleu marine]Image PALM super-résolue de l’anneau FtsZ chez le pneumocoque.[/bleu marine]