Menu
Institut de Biologie StructuraleGrenoble / France

Contacts relatifs à cet article / Eric Forest

Echange hydrogène/deutérium - spectrométrie de masse

Présentation

Passeur CTC et UHPLC Agilent derrière le spectromètre de masse Agilent

L’échange hydrogène/deutérium associé à la spectrométrie de masse (SM) permet l’identification assez précise (5-10 acides aminés) de régions de protéines (solubles ou membranaires) impliquées dans des changements de conformation ou des interactions avec des partenaires.
Il permet en particulier de cartographier la stabilité d’un anticorps et d’identifier des épitopes.

La technique nécessite l’incubation dans un tampon deutéré d’une protéine sous différentes formes ou en présence et en absence de son partenaire, pour échanger certains hydrogènes amidiques avec du deutérium. Après bloquage des deutériums échangés et protéolyse de la protéine, la masse des différents peptides est mesurée par SM.
-  Changements conformationnels : pour un peptide de la protéine sous différentes formes, les différences de masse indiquent les différences d’incorporation de deutérium et ainsi les changements locaux de conformation ;
-  Identification d’interface : une diminution de masse pour un peptide de la protéine entre la forme libre et la forme complexée indique que la région de ce peptide est impliquée dans l’interface avec le partenaire.

La technique a été automatisée récemment, depuis le traitement de l’échantillon jusqu’à l’exploitation informatique des données.

HDX of peptides using BmrA 3-D models

Modèles 3-D de BmrA en conformation ouverte (à gauche) et en conformation fermée (à droite). Une sous-unité a été colorée en beige et l’autre en gris. Les peptides identifiés sont dessinés avec des couleurs arc-en-ciel (pour un monomère et pour tous les ICDs) selon leur pourcentage d’échange deutérium après 3600 s (échelle d’échange montrée à droite).
Mehmood, S., Domene, C., Forest, E. & Jault, J.-M. (2012). Dynamics of a bacterial multidrug ABC transporter in the inward and outward facing conformations. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 109, 10832-10836.

Mots clé

Echange hydrogène/deutérium ; spectrométrie de masse ; anticorps ; épitope ; interaction ; conformation

Equipement spécifique

-  Echantillonneur CTC
-  Enceinte avec vannes et colonnes refroidie par bloc Peltier
-  Pompes HPLC Agilent
-  Spectromètre de masse electrospray Agilent
- logiciel HDExaminer Sierra Analytics

Accessibilité

Les laboratoires académiques ont accès à cette plate-forme sous forme de projets collaboratifs dans le cadre d’une réponse à appel d’offre (ANR, UE, etc) et/ou avec participation de personnel impliqué dans l’étude.
Les laboratoires industriels ont accès sous forme de contrats, après signature d’un accord de confidentialité.

Echantillons

Une étude consomme quelques centaines de μg de protéine pure et homogène à une concentration minimum de 5 μM et dure de quelques semaines à quelques mois.
Les protéines glycosylées doivent avoir fait l’objet d’une identification des glycosylations ou d’une déglycosylation complète.
Les protéines membranaires peuvent être étudiées si elles sont solubles dans le DDM. D’autres détergents non ioniques (Triton X100, à base de polyoxyéthylène, PEG, PPG) sont également envisageables.

Résultats

Les résultats sont inclus dans des publications avec intégration dans la liste des auteurs dans le cadre d’un projet collaboratif.
Ils font l’objet d’un rapport dans le cadre d’une étude industrielle.

Contact

Pour toute information sur la faisabilité, les moyens nécessaires et la mise en place d’une étude, contacter Eric Forest.

Publications

Pour un aperçu des projets abordés à l’IBS avec cette technique, voici :
- Quelques publications :

Mehmood, S., Domene, C., Forest, E. & Jault, J.-M. (2012). Dynamics of a bacterial multidrug ABC transporter in the inward and outward facing conformations. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 109, 10832-10836.

Rey, M., Man, P., Clemencon, B., Trezeguet, V., Brandolin, G., Forest, E. & Pelosi, L. (2010). Conformational Dynamics of the Bovine Mitochondrial ADP/ATP Carrier Isoform 1 Revealed by Hydrogen/Deuterium Exchange Coupled to Mass Spectrometry. Journal of Biological Chemistry 285, 34981-34990.

Marcoux, J., Man, P., Castellan, M., Vives, C., Forest, E. & Fieschi, F. (2009). Conformational changes in p47(phox) upon activation highlighted by mass spectrometry coupled to hydrogen/deuterium exchange and limited proteolysis. Febs Letters 583, 835-840.

Man, P., Montagner, C., Vernier, G., Dublet, B., Chenal, A., Forest, E. & Forge, V. (2007). Defining the interacting regions between apomyoglobin and lipid membrane by hydrogen/deuterium exchange coupled to mass spectrometry. Journal of Molecular Biology 368, 464-472.

Brier, S., Lemaire, D., DeBonis, S., Forest, E. & Kozielski, F. (2004). Identification of the protein binding region of S-trityl-L-cysteine, a new potent inhibitor of the mitotic kinesin Eg5. Biochemistry 43, 13072-13082.

Cravello, L., Lascoux, D. & Forest, E. (2003). Use of different proteases working in acidic conditions to improve sequence coverage and resolution in hydrogen/deuterium exchange of large proteins. Rapid Communications in Mass Spectrometry 17, 2387-2393.
- La liste de l’ensemble des publications de l’IBS mettant en jeu cette technique.