2012

Conception rationnelle d’une protéine fluorescente cyan remarquablement efficace

Des chercheurs grenoblois de l’IBS (Institut de biologie structurale, CEA-CNRS-UJF) et de l’ESRF (European Synchrotron Radiation Facility), en collaboration avec des équipes des Universités d’Amsterdam et d’Oxford, ont réussi, en combinant biologie structurale et ingénierie génétique, à mettre au point une nouvelle protéine fluorescente cyan (CFP) dont l’efficacité de fluorescence est la meilleure jamais obtenue pour cette famille des protéines.
Grâce à leur fluorescence naturelle, les protéines fluorescentes sont facilement repérables et traçables dans l’organisme. Elles constituent aujourd’hui de très bons marqueurs biochimiques et biologiques et sont indispensables à l’utilisation de certaines techniques d’imagerie cellulaire. Les protéines fluorescentes cyan (CFP) et jaunes (YFP) sont utilisées pour visualiser, par la technique dite de FRET, des interactions « protéine-protéine » ou des changements conformationnels dans des réactions en cascade de signalisation cellulaire. Malheureusement, ces protéines ont longtemps souffert d’un faible niveau de fluorescence. Avec ces travaux, les chercheurs ont voulu comprendre quelle était l’origine de cette faible efficacité de fluorescence. Dans un premier temps, les chercheurs de Grenoble et d’Oxford ont caractérisé la structure tridimensionnelle de plusieurs CFP au niveau de fluorescence variable et caractérisé leur dynamique structurale. Ils ont ainsi repéré les régions de la protéine responsables de son efficacité de fluorescence. Grâce à ces données, leurs collègues d’Amsterdam ont dans un second temps, grâce à une méthode innovante de caractérisation de mutants à haut débit, pu développer une CFP, dénommée mTurquoise2, dont l’efficacité de fluorescence, en termes d’intensité et de durée de vie, est la meilleure jamais obtenue pour cette famille de protéines. Les chercheurs disposent maintenant avec mTurquoise2 d’un un outil pouvant aider à visualiser des événements cellulaires avec un niveau de sensibilité sans précédent et à réaliser des expériences dont les résultats auraient auparavant été cachés dans le bruit.

Communiqué de presse

Structure-guided evolution of cyan fluorescent proteins towards a quantum yield of 93%, J. Goedhart, D. von Stetten, M. Noirclerc-Savoye, M. Lelimousin, L. Joosen, M. A. Hink, L. van Weeren, T. W. Gadella Jr, and A. Royant, Nat. Commun. (2012)

L’IBS, acteur de l’infrastructure européenne intégrée de biologie INSTRUCT

La recherche dans le domaine biomédical dispose, avec le lancement officiel de INSTRUCT le 23 février 2012, d’une nouvelle infrastructure de recherche dans le domaine de la biologie structurale. Instruct va permettre aux scientifiques à travers l’Europe d’accéder à un panel complet de technologies intégrées parmi les plus avancées au monde, grâce à la collaboration d’instituts européens leaders en biologie structurale.

Un catalogue complet des technologies accessibles est disponible sur www.structuralbiology.eu . Le site comporte également des offres d‘emploi, des informations sur des programmes académiques ou des événements scientifiques, des forums de discussion et abrite des réseaux de scientifiques travaillant sur des projets communs.

Grenoble (avec le PSB) et Strasbourg (avec l’IGBMC) sont les deux centres de référence français de Instruct parmi les 15 centres européens labellisés. L’Institut de Biologie Structurale met à disposition plusieurs plate-formes (Cryo EM, MP3 et NMR) avec les compétences qui les accompagnent.

Un peptide pour mimer un sucre et inhiber l’entrée du VIH dans les cellules

L’entrée du VIH dans les cellules repose sur l’interaction de la protéine d’enveloppe du virus (gp120) avec le récepteur CD4 et les GPCR CCR5 ou CXCR4. Cette double interaction représente donc une cible pharmacologique d’intérêt dans des stratégies visant à inhiber l’entrée du virus.
Dans cette perspective, le groupe SAGAG de l’IBS a solubilisé CCR5 et CXCR4 par un cocktail de lipides et de détergents, permettant de conserver leurs fonctions de reconnaissance et d’effectuer des mesures d’interactions par SPR entre gp120 et ces récepteurs. Par ailleurs, des travaux précédents avaient montré que les héparanes sulfate (HS) se liaient à gp120 et interféraient avec l’entrée virale. La complexité des HS ne permettant pas d’identifier aisément les déterminants moléculaires impliqués dans l’interaction, des peptides contenant des sulfotyrosines (dont le nombre et la position peuvent être facilement modifiés) et mimant ces polysaccharides ont été générés.
En combinant ces deux aspects (mesure d’interaction gp120/GPCR et génération de mimétiques d’oligosaccharides), une molécule, appelée mCD4-P3YSO3, a été développée, en collaboration avec l’Institut Pasteur et l’Université d’Orsay. Cette molécule inhibe l’interaction de gp120 avec CD4, CCR5 ou CXCR4 et bloque la réplication d’isolats cliniques du VIH avec des IC50 de 0,5 nM. Ces résultats positionnent ce composé de manière favorable pour le développement d’un inhibiteur du VIH.

A synthetic heparan sulfate-mimetic peptide conjugated to a mini CD4 displays veryhigh anti-HIV-1 activity independently of coreceptor usage. Connell B.J., Baleux F., Coic YM., Clayette P., Bonnaffé D and Lortat-Jacob H. Chemistry & Biology 19 (1) 131-139 (2012)

Mécanismes moléculaires de la biogenèse du pilus chez Streptococcus pneumoniae

Modèle d’assemblage du pilus de S. pneumoniae

RrgB forme la fibre polymérique du pilus. L’adhésine RrgA est associée à l’extrémité du pilus mais également le long de la fibre favorisant l’interaction du pilus avec les récepteurs de l’hôte. La multimérisation de RrgA devrait également renforcer l’avidité de cette reconnaissance. RrgC est supposé ancrer le pilus dans la paroi bactérienne. Le rôle de chacune des sortases est indiqué ainsi que la séquence possible de leur intervention dans la genèse du pilus. (El Mortaji, Biochemistry 2012)

Streptococcus pneumoniae est un pathogène majeur chez l’homme, responsable d’otites, de pneumonies, de septicémies et de méningites. Récemment des structures de type pilus ont été identifiées à la surface de S. pneumoniae qui jouent un rôle important dans les étapes initiales de colonisation des tissus hôtes. Six gènes sont impliqués dans la formation de cette structure. Trois d’entre eux codent pour les protéines structurales ou pilines (RrgA, RrgB et RrgC) et trois autres gènes codent pour les enzymes, appelées sortases, catalysant l’association covalente des pilines (SrtC-1, SrtC-2 et SrtC-3).
La caractérisation structurale des pilines RrgA, RrgB et RrgC réalisée grâce à une collaboration entre les Groupes Pneumocoque et Pathogénie Bactérienne de l’IBS, a mis en évidence la présence d’un type nouveau de modification post-traductionnelle, il s’agit de ponts intramoléculaires Lys-Asn, au sein de chacune des pilines dont le rôle stabilisateur a été démontré. De plus, la résolution des structures cristallographiques de RrgA et RrgB a permis d’élucider certains aspects du processus d’assemblage du pilus ainsi que ses propriétés adhésives. Afin de définir la spécificité de substrat de chacune des trois sortases, nous avons développé un système de co-expression des pilines et des sortases dans le système recombinant E. coli. Cette étude a permis d’identifier des complexes piline/sortase et piline/piline dont la formation est spécifiquement catalysée par les sortases. L’ensemble de ces travaux a permis d’obtenir des éléments clés dans la compréhension de la biogenèse du pilus chez S. pneumoniae et de proposer un nouveau modèle d’assemblage du pilus.

• Manzano C., Contreras-Martel C., El-Mortaji L., Izore T., Fenel D., Vernet T., Schoehn G., Di Guilmi A.M., Dessen A. (2008). Structure, 16, 1-11.
• Manzano C., Izore T., Job V., Di Guilmi A.M., Dessen A. (2009) Biochemistry, 48, 10549-10557.
• El Mortaji L., Terrasse R., Dessen A., Vernet T., Di Guilmi A.M. (2010) J. Biol. Chem. 285, 12405-12415.
• Izoré T., Contreras-Martel C., El-Mortaji L., Manzano C., Terrasse R., Verne.t T., Di Guilmi A.M., Dessen A. (2010) Structure 18, 106-115.
• El Mortaji L., Fenel D., Vernet T., Di Guilmi A.M. (2012) Biochemistry. Under press
• El Mortaji L., Contreras-Martel C., Moschioni M., Ferlenghi I., Manzano C., Vernet T., Dessen A., Di Guilmi A.M. (2012) Biochemical J. 441, 833-841

Inhibition de l’infection VIH dans des échantillons de tissus utérins humains

Il y a plus d’un an et demi, notre équipe a contribué, dans le cadre d’un travail collaboratif européen, à une première étude montrant que des molécules anti-DC-SIGN (des dendrons de glycomimics produits au sein de notre réseau), étaient capables de bloquer, sur des cellules, la trans-infection, dépendante de DC-SIGN, du virus HIV vers les lymphocytes T.
Dans la droite ligne de ce travail, un nouveau cap vient d’être franchi avec ce travail que nous venons de publier dans AIDS. En effet, au delà de la transfection c’est maintenant l’inhibition directe à l’infection au VIH dont nous venons de démontrer la pertinence au travers de notre approche et, cette fois, non plus uniquement sur des préparations cellulaires mais également directement sur des échantillons de tissus utérins humains ("cervical explant").
Au delà des résultats prometteurs de cette stratégie anti-infectieuse, nous montrons aussi que nos inhibiteurs, via leur interaction avec DC-SIGN, contribuent à l’augmentation de la production des chimiokines MIP1-a, MIP1-b et Rantes, ligand de CCR5. Ils sont donc capables de contribuer à une signalisation intracellulaire. Cet effet s’ajoute probablement à l’effet biologique, ces chimiokines étant les ligands naturels du récepteur CCR5 qu’utilise le virus pour infecter les cellules cibles. Ainsi, les chimiokines nouvellement produites pourraient contribuer au blocage de ces récepteurs et donc à l’infection observée.
Cette étude confirme la pertinence de notre approche dans la recherche de nouvelles molécules pouvant être utilisées dans le cadre d’une stratégie de prévention basée sur le concept de microbicides. Nous montrons dans ce travail une spécificité d’inhibition à l’égard du récepteur DC-SIGN (détourné par le VIH) sans inhiber l’action de la langerine, un récepteur analogue mais qui contribue lui à l’élimination du virus.
Notre consortium poursuit ses efforts dans l’amélioration de ces molécules. Une prochaine génération d’entre elles avec une affinité d’ores et déjà améliorée est en train d’émerger dans nos laboratoires...

A glycomimetic compound inhibits DC-SIGN-mediated HIV infection in cellular and cervical explant models. Berzi A, Reina JJ, Ottria R, Sutkeviciute I, Antonazzo P, Sanchez-Navarro M, Chabrol E, Biasin M, Trabattoni D, Cetin I, Rojo J, Fieschi F, Bernardi A, Clerici M. AIDS. 2012 Jan 14 ;26(2):127-137.