Reconstitution in vitro de la voie de réparation de l’ADN par excision de nucléotides de D. radiodurans

La réparation de l’ADN par excision de nucléotides (NER) est une voie de réparation de l’ADN capable d’éliminer des lésions très diverses de l’ADN, telles que les photoproduits de pyrimidine-pyrimidone (6-4) (6-4-PP), les dimères de cyclobutane-pyrimidine (CPD) et un large éventail de lésions créant des distorsions de la double hélice de l’ADN, dont les adduits. Chez les bactéries, cette voie est assurée par les protéines UvrA, UvrB et UvrC qui agissent séquentiellement pour libérer un oligonucléotide contenant la base endommagée. Dans ce travail, nous avons réussi à reconstituer un système NER bactérien efficace en utilisant un oligonucléotide original doublement marqué et des protéines UvrABC purifiées provenant de la bactérie radio-résistante, Deinococcus radiodurans.

Par rapport aux systèmes NER déjà existant, deux changements importants ont en effet été mis en œuvre. Premièrement, nous avons utilisé un oligonucléotide contenant une thymine conjuguée à la fluorescéine en position centrale, un substrat bien établi du NER, mais aussi un fluorophore rouge supplémentaire à l’extrémité 5’ du brin contenant la lésion. Ces deux marquages nous ont permis de suivre les différents produits résultant de l’incision par les protéines Uvr. Deuxièmement, les protéines ont toutes été purifiées à partir d’un seul organisme, D. radiodurans, une bactérie mésophile. Grâce à ces protéines très stables, nous avons pu suivre le test sur des durées plus longues et travailler sur chaque composant de notre système. Ces deux caractéristiques nous ont permis de tester de nombreuses conditions afin d’optimiser le test d’incision in vitro pour obtenir une incision complète du substrat.

Ce test d’incision nouvellement développé sera sans aucun doute un outil utile pour des études ultérieures de la voie NER bactérienne. Le fait qu’il ait été entièrement optimisé va maintenant nous permettre de disséquer la contribution de chaque composant à la réaction de réparation. En nous appuyant sur ce travail, nous espérons ainsi prochainement faire la lumière sur certains des mécanismes complexes qui sous-tendent la NER.

Seck A, De Bonis S, Saint-Pierre C, Gasparutto D, Ravanat JL & Timmins J. In vitro reconstitution of an efficient nucleotide excision repair system using mesophilic enzymes from Deinococcus radiodurans. Communications Biology (2022). 5, 127. DOI : 10.1038/s42003-022-03064-x.