Soutenance de thèse : Caractérisation de l’organisation spatiale de SIRP αlpha et du cholestérol membranaire au sein de la synapse phagocytaire des macrophages humains

Par Quentin Depeyre (IBS/Groupe Imagerie Intégrée de la Réponse au Stress)

La voie CD47-SIRPα constitue un point de contrôle immunitaire spécifique aux cellules phagocytaires professionnelles que sont les macrophages. Cette voie est l’objet de nombreux travaux pour le développement de nouvelles stratégies thérapeutiques, notamment dans les cancers solides. Au-delà de l’interaction entre ces deux partenaires, la localisation et l’organisation spatiale des complexes moléculaires à l’interface macrophage-cellule cible pourraient contribuer à moduler la signalisation inhibitrice résultant de leur interaction. Le cholestérol, en raison de son influence sur les propriétés de la membrane plasmique, pourrait participer à cette structuration. Toutefois les relations entre le cholestérol et l’organisation de l’axe CD47-SIRPα restent peu caractérisées. Ce travail de thèse visait à caractériser l’organisation de SIRPα et du cholestérol à la membrane du macrophage en contact avec des cellules tumorales par microscopie à super-résolution.

Un modèle de coculture de macrophages THP1 et de cellules d’ostéosarcome humain U2OS, a été mis au point pour l’imagerie à super-résolution. La distribution de SIRP&alpha à l’interface a été caractérisée par microscopie confocale et SMLM en deux et trois dimensions. Des perturbations de la dynamique membranaire par différents inhibiteurs de voies cellulaires impliquant le protéasome, la dégradation lysosomale ou l’endocytose ont également été utilisées pour explorer les mécanismes associés à cette distribution de SIRPα. Au contact des U2OS irradiées, SIRPα présente une forte diminution de densité par rapport aux régions périphériques et hors contact, contrairement aux U2OS non irradiées. Cette observation s’accompagne d’une réduction du nombre et de la surface des clusters de SIRPα à l’interface. Cette redistribution n’est plus observée en présence de Dynasore, suggérant une contribution potentielle de l’endocytose à la réorganisation de SIRPα lors d’un contact avec une cible apoptotique. Ce processus impliquant la dynamine reste à caractériser plus finement au niveau moléculaire.

En parallèle, afin d’étudier le rôle du cholestérol dans l’organisation moléculaire de l’interface phagocytaire à l’échelle nanométrique, une sonde fluorescente fondée sur le domaine D4H, dérivé de la toxine perfringolysine O et reconnaissant une fraction du cholestérol accessible à la membrane plasmique, a été développée. La fusion de ce domaine à la protéine fluorescente mEos4Fast1 (GST-D4H*-mEos4Fast1) a permis son utilisation en microscopie de localisation de molécules uniques. Les analyses de la distribution du cholestérol en relation avec CD47 et SIRPα, notamment après perturbation de l’homéostasie du cholestérol, apportent de premiers éléments en faveur d’une association entre le cholestérol membranaire et l’organisation moléculaire de l’interface phagocytaire.
Ainsi, ce travail met en évidence une organisation spatiale spécifique de SIRPα au contact de cellules irradiées et fournit un outil permettant d’explorer l’environnement lipidique de l’interface CD47-SIRPα à l’échelle nanométrique. Ces résultats ouvrent la voie à l’étude des relations entre le cholestérol de la membrane plasmique, l’organisation de SIRPα et la signalisation de ce point de contrôle immunitaire.

Mots-clés : SIRPα, CD47, D4H, macrophages, cholestérol accessible, SMLM