Soutenance de thèse : Développement d’une thérapie à base de protéoliposomes pour lutter contre les infections pulmonaires aiguës - Application à la maladie Granulomatose Septique Chronique

Par Perrine Rochas (IBS/Groupe Membrane et pathogènes)

Les infections pulmonaires aiguës sont la première cause de mortalité dans les syndromes d’immunodéficiences innées comme la Granulomatose Septique Chronique (CGD). La CGD est due à un déficit fonctionnel du complexe NADPH-oxydase des cellules phagocytaires, formé d’un hétérodimère membranaire NOX2/p22^phox et de facteurs cytosoliques (p47^phox, p67^phox, p40^phox, et rac2). La forme majoritaire de la CGD est de transmission liée à l’X (CGD-X) et affecte le complexe NOX2/p22^phox(cytochrome b₅₅₈ ou cytb₅₅₈), entrainant une absence de production de dérivés toxiques de l’oxygène microbicides. Ainsi la première cause de décès du patient en réanimation est la pneumopathie infectieuse aiguë réfractaire à l’antibiothérapie intraveineuse, seules des transfusions de cellules phagocytaires isolées d’un donneur compatible peuvent l’enrayer. Mais cette pratique compromet la possibilité ultérieure de greffe de moelle, en augmentant le risque de rejet.
Une thérapie par inhalation de protéoliposomes (PLs) thérapeutiques contenant le cytb₅₅₈ serait une alternative idéale pour lutter contre les infections pulmonaires sévères des patients CGD-X, en restaurant temporairement l’activité NADPH-oxydase au niveau des macrophages alvéolaires déficients. De plus, ces PLs pourraient être utilisés plus largement dans des pneumopathies dues à diverses immunodéficiences secondaires ou dans certaines maladies infectieuses afin de booster l’immunité innée naturelle des patients. Le traitement direct des macrophages alvéolaires par inhalation de PLs pourrait donc augmenter la durée de vie des patients et permettre de contourner les problèmes de clairance hépatique et d’interaction avec le sang qui se posent avec les liposomes administrés par injection. La production du cytb558 directement en liposome par un « cell-free-system » dérivé d’E. coli et la preuve de concept (POC) de son efficacité thérapeutique in cellulo ont été préalablement montrés par notre équipe, mais les PLs cytb₅₅₈ n’étaient que partiellement purifiés et la quantité insuffisante pour envisager une POC in vivo.
Une nouvelle méthode de production de PLs thérapeutiques a été développée basée sur la surexpression du complexe NOX2/p22^phox par transduction lentivirale dans des cellules mammifères HEK-293T-Rex. La solubilisation du cytb558 à partir des membranes des cellules HEK293T-Rex puis sa purification par diverses méthodes de chromatographie d’affinité ont été optimisées pour maintenir son activité NADPH-oxydase. La co-expression de la chaperonne EROS de NOX2 a également permis d’augmenter les rendements de production du cytb₅₅₈. Sa colocalisation avec NOX2 et divers marqueurs intracellulaires a été démontrée par microscopie confocale. Enfin, la reconstitution de l’environnement membranaire en liposomes a été optimisée en testant différentes compositions lipidiques permettant le maintien de l’activité NADPH-oxydase. Pour certaines compositions lipidiques, la fusion des PLs cytb₅₅₈ avec la membrane de macrophages humains déficients en cytb₅₅₈ (CGD-X⁰), différenciés à partir de cellules souches pluripotentes induites (IPSc) humaines, a été testée. En effet la différenciation des IPSc permet d’obtenir des progéniteurs hématopoïétiques CD34⁺, qui sont ensuite différenciés en macrophages. L’objectif est, à terme, de pouvoir restaurer l’activité NADPH-oxydase dans ce modèle pathologique.
Malgré des résultats encourageants d’accumulation des PLs NOX2/p22^phox à la membrane des macrophages CGD-X⁰ montrés par cytométrie en flux, aucune restauration d’activité NADPH-oxidase n’a pu encore être observée. Ce résultat peut s’expliquer par une endocytose des PLs cytb₅₅₈ par les cellules macrophagiques plutôt qu’une fusion des lipides des PLs au niveau de la membrane, observée en microscopie confocale. Une optimisation de la composition des liposomes sera donc nécessaire pour favoriser la fusion des lipides permettant de délivrer le cytb558 au niveau de la membrane pour un potentiel thérapeutique optimal.