Comment une protéine fluorescente commute t-elle dans le froid ?
Les méthodes de biologie structurale ont souvent bénéficié de leur « version cryogénique ». La cristallographie aux rayons X et la microscopie électronique ont été révolutionnées par la possibilité de refroidir rapidement les échantillons biologiques, ce qui a permis de réduire respectivement, les dommages causés par les radiations ou de mieux préserver l’état natif des macromolécules étudiées. Avec le développement de la microscopie à super-résolution (nanoscopie), la question se pose maintenant de passer à la cryo-nanoscopie. Cette approche a déjà été démontrée par plusieurs laboratoires de premier plan, notamment dans le but de réaliser des études cryo-corrélatives (cryo-CLEM). L’obtention de bonnes images de cryo-nanoscopie se heurte toutefois à un obstacle de taille lorsque la technique SMLM (Single Molecule Localization Microscopy) est utilisée. Pour que cette technique fonctionne, les fluorophores utilisés pour marquer la molécule d’intérêt doivent passer efficacement d’un état non-fluorescent à un état fluorescent. Cependant, dans le cas des protéines fluorescentes, cette propriété de commutation est généralement réduite ou abolie à température cryogénique, car la commutation dépend de la dynamique de la protéine qui est quasiment arrêtée en dessous de la température de transition vitreuse.
Dans ce travail, les membres de l’équipe Pixel du groupe Imagerie Intégrée de la Réponse au Stress (I2SR/Pixel), en collaboration avec l’Université de Göttingen en Allemagne, ont montré que rsEGFP2, une protéine fluorescente qui commute rapidement à température ambiante, commute toujours à 100K, mais selon un mécanisme entièrement différent qui implique probablement des états radicalaires au lieu de l’isomérisation cis-trans du chromophore. En outre, les travaux démontrent que la fraction de molécules rsEGFP2 qui peuvent commuter efficacement avant photoblanchiment est nettement améliorée par l’utilisation d’une illumination UV à 355 nm au lieu de l’illumination violette à 405 nm classiquement utilisée. L’étude ouvre donc la voie à l’obtention d’images cryo-SMLM plus nettes.
Photophysical Studies at Cryogenic Temperature Reveal a Novel Photoswitching Mechanism of rsEGFP2. Angela M. R. Mantovanelli,§ Oleksandr Glushonkov,§ Virgile Adam,§ Jip Wulffelé, Daniel Thédié, Martin Byrdin, Ingo Gregor, Oleksii Nevskyi, Jörg Enderlein, and Dominique Bourgeois. Journal of the American Chemical Society 2023 ; 145(27):14636-14646. doi : 10.1021/jacs.3c01500.