Nous développons la microscopie super-résolution PALM, une des principales méthodes de localisation de molécules uniques (SMLM). Dans notre définition, les techniques PALM rassemblent l’ensemble des techniques de type SMLM utilisant des protéines fluorescentes phototransformables (PTFPs) comme marqueurs. Le PALM et ses dérivés qPALM, cryoPALM et sptPALM sont fondamentalement basés sur les propriétés photophysiques de ces PTFPs, ce qui fait la cohérence de nos activités.
Notre microscope PALM est utilisé pour étudier les PTFPs in cellulo ou in vitro au niveau de la molécule unique. Nous menons 3 activités principales :
– Nous développons la microscopie PALM à température cryogénique (cryo-PALM) qui constitue une des évolutions majeures du domaine actuellement, notamment pour les applications en biologie structurale intégrée basées sur la microscopie corrélative (cryo-CLEM). Pour ce projet nous bénéficions d’un cryo-microscope développé par l’équipe allemande de Jörg Enderlein (Université de Göttingen). Notre but consiste à d’étudier les propriétés de photocommutation des PTFPs à basse température, à réaliser l’ingénierie de protéines fluorescentes mieux adaptées au cryo-PALM, ou à améliorer les protocoles d’illumination laser lors d’une collecte cryo-PALM. Par exemple, nous avons récemment découvert un nouveau mécanisme de photocommutation se produisant à température cryogénique chez rsEGFP2, et montré qu’une illumination à 355 nm permettait d’augmenter l’efficacité de marquage.
– Nous étudions comment la photophysique des protéines fluorescentes photoconvertibles telles que les variants de mEos affectent les techniques qPALM et sptPALM. Par exemple, nous avons trouvé une méthode pour augmenter la longueur des traces en sptPALM avec les variants de mEos, en ajoutant une faible illumination à 488 nm pendant la collecte des données. Nous avons aussi récemment montré que, en raison d’un mécanisme de photoblanchiment non linéaire, l’utilisation de fortes intensités de lumière à 405 nm peut être très délétère pour l’efficacité de marquage en qPALM. Enfin, notre travail en collaboration avec le groupe RMN de l’IBS a permis de découvrir l’existence de plusieurs états conformationnels chez les protéines mEos comme mEos4b, à la fois dans leurs états vert et rouge, avec des conséquences sur les mécanismes de photoconversion et de scintillement (blinking) dans les expériences PALM.
– Nous développons un simulateur d’imagerie de molécules uniques appelé SMIS qui, contrairement à tous les simulateurs disponibles à ce jour, intègre une description avancée des propriétés spectrales et photophysiques des fluorophores. SMIS permet d’effectuer des simulations complexes capables de prédire par exemple les effets de diverses conditions d’illumination dans une expérience PALM, ou les effets subtils de crosstalks dans des expériences SMLM multicouleurs.