Tomographie / Cryo-FIB SEM
La tomographie électronique permet de visualiser un échantillon protéique ou cellulaire en trois dimensions à partir d’images bidimensionnelles obtenues en imageant l’objet d’intérêt dans différentes orientations : 40 à 60 images du même échantillon sont collectées, après l’avoir incliné à différents angles par rapport au faisceau d’électrons. Après alignement de la série d’images inclinées, on obtient un tomogramme de l’échantillon. La tomographie électronique peut être réalisée à température ambiante ou en conditions cryogéniques. Elle peut également être couplée à l’ultra-(cryo)-microtomie pour imager des coupes de cellules.
À température ambiante, l’information tridimensionnelle permet par exemple de visualiser une bille d’or couplée à un anticorps, permettant ainsi de localiser un antigène dans le volume d’une cellule ou d’une coupe de cellule.
![<multi>[fr]Un échantillon présent dans la glace vitreuse est imagé à différents angles par rapport au faisceau d'électrons. À partir de cette série d'images inclinées, un cryo-tomogramme ou volume 3D de l'échantillon est reconstruit. Plusieurs sous-volumes contenant des sous-domaines identiques de l'échantillon sont extraits, alignés et moyennés pour obtenir un modèle 3D. [en]A vitrified sample is imaged at different angles to the electron beam. From this series of tilted images, a cryo-tomogram or 3D volume of the sample is reconstructed. Several sub-volumes containing identical sub-domains of the sample are extracted, aligned and averaged to obtain a 3D model. </multi>](IMG/png/principe-de-la-cryo-tomographie-electro-nique-et-du-moyennage-de-sous-volumes-adapte-de.png)
Principe de la cryo-tomographie électronique ((c) D. Levy)
La cryo-tomographie électronique permet d’analyser des complexes protéiques multi-composants ou encore des virus difficiles à purifier hors de leur environnement natif et d’obtenir leur organisation 3D.
Comparé à la cryo-microscopie "classique" (particules isolées), la résolution n’est que de quelques nm, le rapport signal sur bruit étant plus faible (dose d’électrons par image plus faible et échantillon plus épais (100-300 nm)).
En effectuant une moyenne des sous-tomogrammes ("sub-tomogram averaging") on peut obtenir des modèles 3D d’objets présents dans les tomogrammes (les particules sont dans ce cas des sous-volumes et non des projections 2D). L’alignement et le moyennage d’un grand nombre de sous-volumes vont permettre d’augmenter le rapport sur bruit et donc la résolution.
La cryo-tomographie électronique cellulaire est une technique de pointe évoluant rapidement vers l’imagerie in situ à haute résolution. Cette technique peut être réalisée sur de petits procaryotes, à la périphérie de cellules eucaryotes adhérentes ou sur des organites isolés. Dans le cas d’échantillons plus volumineux, la cryo-tomographie peut aussi être utilisée sur des coupes cryogéniques de cellules, obtenues par CEMOVIS ou cryo-FIB SEM.
