Equipe Burmeister : Activités de recherche


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Introduction

L’une des grandes réussites de la médecine moderne a été l’éradication du virus de la variole déclarée en 1979 après une longue campagne de vaccination avec le prototype du poxvirus, le virus de la vaccine (VACV), qui est également un système modèle sûr. Pourtant, la famille des poxvirus comprend des membres ayant un fort potentiel de propagation à partir du règne animal comme les virus de la variole du singe et de la vache qui représentent le principal risque. Au début de l’été 2022, cette crainte s’est réalisée avec une épidémie de la variole de la singe à l’échelle mondiale se transmettant principalement par des rapport sexuels entre hommes. Auparavant, la variole du singe a surtout donné lieu à des épidémies locales en République démocratique du Congo et en Afrique de l’Ouest avec environ 5 000 cas par an et un taux de mortalité d’environ 2 %. Même avec le reflux actuel du nombre de cas, une future évolution du virus vers une transmission humaine plus efficace ne peut pas être exclue une fois le virus établi dans la population humaine.
Il est donc essentiel de se préparer aux infections à poxvirus par la disponibilité d’un panel d’antiviraux ; mais, à ce jour, il n’existe que deux molécules, le brincidofovir (qui s’est révélé trop toxique lors de l’actuelle épidémie) et le tecovirimat. Une meilleure connaissance de la structure des protéines des poxvirus en général et de l’ADN polymérase en particulier permettra de développer de nouveaux composés et de mieux comprendre les mécanismes de résistance aux molécules actuelles.

Notre projet

Nous travaillons sur le virus de la vaccine qui est identique à 98 % au virus de la variole et au virus de la variole du singe au niveau des acides aminés des protéines de réplication essentielles : l’hélicase-primase D5, l’holoenzyme de l’ADN polymérase assemblé à partir de la sous-unité catalytique E9 et du facteur de processivité composé de la protéine accessoire A20 et de l’uracile-ADN glycosylase D4 [1]. Au cours des dernières années, nous avons obtenu des informations sur la structure tridimensionnelle de ces protéines et de leurs interfaces à des résolutions croissantes couronné par la structure rayons x de la polymérase E9 [2]et plus récemment, avec une structure de l’interface A20-E9 obtenu par résonance magnétique nucléaire (RMN) structurale [3].
La connaissance détaillée des interfaces des différentes sous-unités de la polymérase pourra être utilisée pour la conception d’inhibiteurs qui interfèrent avec l’assemblage du complexe protéique.

Modèle de travail de l'holoenzyme de l'ADN polymérase
WP Burmeister

Figure 1 : Modèle du complexe de l’holoenzyme E9-A20-D4 de la polymérase. La dimension maximale a été obtenue par SAXS. Les structures à haute résolution obtenues par notre équipe ont été positionnées. L’ADN lié à la polymérase a pu être modélisé alors que l’ADN lié à A20(rés. 1-50)-D4 [4]a été observé dans la structure d’un complexe [5].

En raison de sa dynamique et de sa flexibilité, la structure à haute résolution de l’hélicase-primase D5 est est restée longtemps inaccessible. Nous avons obtenus des informations à basse information sur la structure et l’organisation en domaines [6]. Elle est composé d’un domaine primase côté N-terminus et du domaine hélicase côté C-terminus. D5 a fait l’objet d’études approfondies par diffusion de rayons X à petits angles (SAXS), ce qui a conduit à de nouveaux développements méthodologiques sur la combinaison avec des techniques chromatographiques. Avec l’évolution rapide de la cryo-microscopie électronique et aidé par la prédiction de structure par Alphafold2, nous avons obtenu la structure à 4.1 Å du domaine helicase en complexe avec de l’ADN double brin [7]. Elle a révélé l’architecture de toute une classe de hélicases virales hexamériques.

Domaine hélicase de l'hélicase D5, densité obtenue par cryo-EM avec modèle superposé coloré par domaine
WP Burmeister

Figure 2 : Reconstruction par cryo-microscopie électronique du domaine hélicase de D5 avec un ADN double brin lié (en vert). Les domaines structuraux sont le collier (en jaune), le domaine AAA+ hélicase (en orange) et le domaine C-terminal en violet.

Sur la base de ces résultats, nous travaillons sur le mécanisme de réplication qui réplique la structure unique de l’ADN du génome du poxvirus qui consiste en un ADN double brin linéaire circularisé aux extrémités. L’étude de l’holoenzyme E9-A20-D4 et de D5 en complexe avec des différents ADN sera menée pour avancer au niveau de la compréhension du mécanisme.
Le projet de notre équipe est basé sur une collaboration avec Frédéric Iseni qui dirige le Laboratoire de virologie à l’IRBA, Bretigny-sur-Orge, en région parisienne.

Mots clés

poxvirus, réplication d’ADN, polymérase d’ADN, hélicase, primase, facteur de processivité

Techniques spécialisées

  • Production de protéines recombinantes dans les cellules d’insectes et E. coli
  • Cristallographie aux rayons X
  • Cryo-microscopie électronique
  • Caractérisation biochimique et biophysique (anisotropie par fluorescence, résonance plasmonique de surface, SAXS, dichroïsme circulaire, MALLS, BLI)
  • Microscopie électronique en collaboration avec le groupe Microscopie électronique et méthodes (MEM) à l’IBS.

Notes

[1Sèle, C., Gabel, F., Gutsche, I., Ivanov, I., Burmeister, W.P., Iseni, F. & Tarbouriech, N.
Low-Resolution Structure of the Vaccinia Virus DNA Replication machinery. J. Virol. 87 : 1679-1689. https://doi-org.insb.bib.cnrs.fr/10.1128/JVI.01533-12 (2012).

[2Tarbouriech, N., Ducournau, C., Hutin, S., Mas, P. J., Man, P., Forest, E., Hart, D.J., Peyrefitte, C. N., Burmeister, W. P., & Iseni, F.
The vaccinia virus DNA polymerase structure provides insights into the mode of processivity factor binding. Nat. Comm. https://doi.org/10.1038/s41467-017-01542-z (2017).

[3Bersch, B., Tarbouriech, N., Burmeister, W.P, & Iseni, F.
Solution structure of the C-terminal domain of A20, the missing brick for the characterization of the interface between vaccinia virus DNA polymerase and its processivity factor. J. Mol. Biol., 167009. https://doi.org/10.1016/j.jmb.2021.167009 (2021).

[4Contesto-Richefeu, C., Tarbouriech, N., Brazzolotto, X., Betzi, S., Morelli, X., Burmeister, W. P., & Iseni, F.
Crystal structure of the Vaccinia virus DNA polymerase holoenzyme subunit D4 in complex with the A20 N-terminus domain. PLoS Pathogens 10, e1003978. https://doi.org/10.1371/journal.ppat.1003978 (2014).

[5Burmeister, W.P., Tarbouriech, N., Fender, P., Contesto-Richefeu, C., Peyrefitte, C.N. & Iseni, F. Crystal structure of the vaccinia virus uracil DNA-glycosylase in complex with DNA. J Biol. Chem. 290, 17923-17934. https://doi.org/10.1074/jbc.M115.648352 (2015).

[6Hutin, S., Ling, W. L., Round, A., Effantin, G., Reich, S., Iseni, F., Tarbouriech, N., Schoehn, G. & Burmeister, W. P.
Domain organization of vaccinia virus helicase-primase D5. J. Virol. 90, 4604-13. https://doi.org/10.1128/JVI.00044-16. (2016).

[7Hutin, S., Ling, W.L., Tarbouriech, N., Schoehn, G., Grimm, C., Fischer, U. & Burmeister, W.P.
The Vaccinia Virus DNA Helicase Structure from Combined Single-Particle Cryo-Electron Microscopy and AlphaFold2 Prediction. Viruses 14 (10). https://doi.org/10.3390/v14102206.(2022).