Personnel
Permanents
Rob Ruigrok, Professeur UGA
Thibaut Crépin, Directeur de recherche DR2 CNRS, HDR
Allison Ballandras-Colas, Chargée de recherche CRCN CNRS
Non-permanents
Lily-Lorette Freslon, Assistante-Ingénieure CNRS
Florian Chenavier, Thésard GRAL-UGA
Thèmes de recherche
La nucléocapside du virus de la rougeole (Rob W Ruigrok)
En 1994, un échantillon de nucléoprotéine (N) du virus de la rougeole produite en cellule d’insecte par un étudiant du groupe de Chantal Rabourdin-Combe fut visualisé au laboratoire par microscope électronique (Ravanel et al. J Exp Med. 1997, 186(2):269-78). Nous constatâmes que la protéine était capable de lier les ARN cellulaires et formée des nucléocapsides (figure A). Nous observâmes que le complexe N-ARN formait une hélice lâche dont les anneaux pouvaient facilement se détacher de l’hélice principale. La détermination de la structure hélicoïdale de la nucléocapside du virus de la rougeole pris un certain temps. D’abord avec Guy Schoehn, nous avons observé que la trypsinolyse de N au niveau du résidu 405 permettait d’obtenir des hélices plus compactes qui ont été utilisées pour la première structure par microscopie électronique (1). Ensuite, avec Malene Jensen et Martin Blackledge, nous trouvâmes que la partie C-terminale de N formait une extrémité flexible et désordonnée (NTAIL), commençant au sein de de l’hélice puis s’étendant entre les spires hélicoïdales. Ainsi, la présence de NTAIL favoriserait la flexibilité inhérente de la nucléocapside. La première structure EM fut réalisée avec un microscope Philips CM20 à partir d’images enregistrées sur film. Avec Guy Schoehn et Irina Gutsche, nous avons ensuite utilisé un second microscope (FEI Polara). La structure obtenue à une résolution de 4,3 Å permit de voir à la fois la protéine et aussi l’ARN (9). Cependant, toujours produits en cellules d’insecte, la non-spécificité de l’ARN rendait la densité électronique de la partie ARN de la nucléocapside brouillée. Dans le même temps, Marc Jamin et son étudiant (Filip Yabukarski), ont produit la nucléoprotéine du virus Nipah avec une petite partie de la phosphoprotéine (P) et cristallisé ce complexe, aboutissant ainsi à la première structure cristallographique d’une nucléoprotéine d’un paramyxovirus (6). A partir de cette structure, Guillaume Communie, un étudiant de Martin Blackledge et Rob ainsi que Sigrid Milles, une postdoc, ont conçu une fusion de N et de P reliées par un site de clivage à la protéase TEV et ont ainsi pu observer la liaison de l’ARN concomitante à la dissociation de P. Il a ainsi été possible de générer un complexe N-ARN avec un ARN de séquence connue. Nous avons été surpris de voir que l’extrémité 5’ de l’ARN viral pouvait former des nucléocapsides (11). Nous avons également constaté qu’une séquence polyA permet l’obtention de nucléocapsides mais pas une séquence polyU. Actuellement, avec cette découverte, nous voulons jouer avec N et l’ARN pour :
– obtenir la structure EM à haute résolution pour voir la liaison spécifique des bases de l’ARN,
– obtenir la structure de la nucléocapside avec N entière,
– obtenir la structure de la nucléocapside avec des fragments de P liés,
– changer le NTAIL et mettre une autre protéine ou un domaine pour la conception de nouveaux vaccins,
– étudier la cinétique de formation de nucléocapside par fluorescence.
Figure A : Images de microscopie électronique de nucléocapsides du virus de la rougeole. A gauche, avec la nucléoprotéine intacte et à droite après traitement de la capside par la trypsine.
Influenza virus ribonucléoproteine (Thibaut Crépin)
Le génome du virus de la grippe est composé plusieurs molécules d’ARN encapsidées formant des complexes ribonucléoprotéiques (RNPs - figure B). Chaque RNP est composée d’un segment d’ARN viral, recouvert de multiples copies de la nucléoprotéine (NP) et avec une ARN polymérase ARN-dépendante (RdRp) interagissant spécifiquement avec les extrémités 5’ et 3’ conservées de l’ARN. Chaque RNP constitue une unité fonctionnelle indépendante capable de transcrire et répliquer le segment d’ARN viral dans le noyau de la cellule infectée.
Figure B : Les ribonucleoproteines du virus de la grippe.
En 1992, avec Florence Baudin and Klaus Klumpp, nous regardâmes une préparation de RNPs directement extraite du virus, point de départ de notre travail sur la machinerie réplicative du virus de la grippe. Nous commençâmes à produire de façon recombinante NP afin de déconvoluer les processus d’auto-oligomérisation et d’interaction avec l’ARN de la protéine virale. Plus tard, Sylvie Chenavas, une post-doc de l’équipe, montrât que NP monomérisée à faible concentration de sel (5) et nous obtînmes la structure cristallographique de la forme monomérique de NP (figure C, gauche). Ce travail fut poursuivi par Alice Labaronne qui commença à disséquer les spécificités inhérentes aux différents types de NP (c’est-à-dire la NP des virus grippaux de type A, B, C et D). En parallèle du travail sur NP, nous primes part à la grande aventure visant à caractériser la RdRP hétérotrimérique du virus de la grippe. Ce projet fut une collaboration de notre équipe avec l’antenne de Grenoble de l’EMBL, en particulier les groupes de Stephen Cusack et Darren Hart. La RdRp présente une architecture complexe qui a longtemps résistée à toute expression recombinante. La première stratégie déployée visât à identifier et caractériser des domaines solubles de l’hétérotrimère viral. La contribution de la technologie ESPRIT (Darren Hart) fut un élément déterminant. Différents domaines solubles furent ainsi identifiés (figure C, droite) et l’équipe de concentrât en particulier sur le domaine endonucléase porté par l’une des sous-unités de l’hétérotrimère (2). A la suite de ses travaux, nous nous efforçâmes d’exprimer en cellule d’insecte une forme recombinante de la RdRp hétérotrimérique grâce à une stratégie développée par Imre Berger (EMBL). Alexandre Monod et Christopher Swale, deux thésards de l’équipe, ont mis en place la stratégie (8, 10) qui a permis l’obtention de la structure cristallographique de la RdRp entière (7).
Figure C : Structures cristallographiques des composants des RNPs du virus de la grippe étudiés par notre équipe.
La direction actuellement suivie par l’équipe vise à détailler l’interaction des constituants de la RNP avec les partenaires cellulaires impliqués dans la réplication virale, l’épissage des messagers viraux et le transport nucléaire.
Mots clés
Virus à ARN de polarité négative, virus de la grippe, virus de la rougeole, nucléoprotéine, nucléocapside, épissage viral, transport nucléaire
Techniques spécialisées
Production de protéines recombinantes et de complexes macromoléculaires
Biochimie des protéines et des ARN
Caractérisation biophysique de complexes macromoléculaires
Cristallographie des rayons X
Diffusion des rayons X aux petits angles
Collaborations externes
Imre Berger ; Université de Bristol
Bernard Delmas ; INRA Jouy-en-Josas
Mariette Ducatez, Ecole Nationale Vétérinaire de Toulouse
Denis Gerlier, CIRI, Lyon
Nadia Naffakh, Institut Pasteur
Guido Pintacuda, Centre de RMN à Très Hauts Champs, Lyon
Daniel Gonzalez-Dunia, INFINITy, Toulouse
Etienne Coyaud, PRISM, Villeneuve d’Ascq
Publications marquantes
1. Schoehn, G., Mavrakis, M., Albertini, A., Wade, R., Hoenger, A. & Ruigrok, R.W.H. (2004). 12 Å Structure of trypsin-treated Measles Virus N-RNA. J. Mol. Biol. 339, 301-312.
2. Dias, A., Bouvier, D., Crepin, T., McCarthy, A.A., Hart, D.J., Baudin, F., Cusack, S. & Ruigrok, R.W.H. (2009). The cap-snatching endonuclease of influenza virus polymerase resides in the PA subunit. Nature 458, 914-918.
3. Jensen, M.R., Communie, G., Ribeiro, E.A., Martinez, N., Desfosses, A., Salmon, L., Jamin, M., Mollica, L., Gabel, F., Longhi, S., Ruigrok, R.W.H. & Blackledge, M. (2011). Intrinsic Disorder in Intact Measles Virus Nucleocapsids. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 108, 9839-9844.
4. Ruigrok, RWH., Crépin, T. & Kolakofsky, D. (2011). Nucleoproteins and nucleocapsids of negative-strand RNA viruses. Current Opinion in Microbiology 14, 504–510.
5. Chenavas, S., Estrozi, L.F., Slama-Schwok, A., Delmas, B., Di Primo, C., Baudin, F., Li, X, Crépin, T. & Ruigrok, R.W.H. (2013). Monomeric Nucleoprotein of Influenza A Virus. PLoS Pathog 9(3) : e1003275. doi:10.1371/journal.ppat.1003275.
6. Yabukarski, F., Lawrence, P., Tarbouriech, N., Bourhis, JM., Delaforge, E., Jensen, MR., Ruigrok, R.W.H., Blackledge, M., Volchkov, V. & Jamin, M. (2014). Structure of Nipah virus unassembled nucleoprotein in complex with its viral chaperone. Nat Struct Mol Biol. 21(9):754-759. doi : 10.1038/nsmb.2868.
7. Reich, S., Guilligay, D., Pflug, A., Malet, H., Berger, I., Crépin, T., Hart, D., Lunardi, T., Nanao, N., Ruigrok, R.W.H. & Cusack, S. (2014). Structural insight into cap-snatching and RNA synthesis by influenza polymerase. Nature 516, 361–366. doi : 10.1038/nature14009.
8. Crépin T, Swale C, Monod A, Garzoni F, Chaillet M & Berger I. (2015). Polyproteins in structural biology. Curr Opin Struct Biol. 2015 Jun ;32:139-46. doi : 10.1016/j.sbi.2015.04.007.
9. Gutsche, I., Desfosses, A., Effantin, G., Ling, W.L., Haupt, M., Ruigrok, R.W.H., Sachse, C. & Schoehn, G. (2015). Near-atomic cryo-EM structure of the helical Measles virus nucleocapsid. Science 348, 704-707. doi : 10.1126/science.aaa5137.
10. Swale, C. Monod, A., Tengo, L., Labaronne, A., Garzoni, F., Bourhis, J.M., Cusack, S., Schoehn, G., Berger, I., Ruigrok, R.W.H. & Crépin T. (2016). Structural characterization of recombinant IAV polymerase reveals a stable complex between viral PA-PB1 heterodimer and host RanBP5. Sci Rep. 6, 24727. doi : 10.1038/srep24727.
11. Milles, S., Jensen, M. R., Communie, G., Maurin, D., Schoehn, G., Ruigrok, R. W. H. & Blackledge, M. (2016). Self-assembly of measles virus nucleocapsid particles : Kinetics and RNA sequence dependence. Angew. Chem. Int. Ed., 55, 9356 –9360. DOI : 10.1002/anie.201602619R1.