Institut de Biologie StructuraleGrenoble / France

2019

Décrire la dynamique des protéines intrinsèquement désordonnées jusqu’à dans la cellule

Les scientifiques estiment qu’un tiers des protéines humaines sont intrinsèquement désordonnées (PIDs), c’est à dire sans structure tridimensionnelle stable. Très flexibles, elles peuvent s’adapter à plusieurs partenaires physiologiques et adoptent une multitude de conformations. Leur fonctionnement reste peu compris même si elles jouent des rôles essentiels dans toutes les organismes vivants. Les chercheurs du groupe FDP de l’IBS font appel à la spectroscopie RMN (résonance magnétique nucléaire) pour en savoir plus. Cet outil, extrêmement sensible pour l’étude de systèmes moléculaires hautement dynamiques, permet la caractérisation précise de la dynamique conformationnelle à longue portée et locale des PIDs et de leurs complexes, à une résolution atomique.
Dans cette étude, les chercheurs ont développé des méthodes pour décrire la dynamique de ces protéines sur des échelles de temps qui diffèrent presque par trois ordres de grandeur. Grace à ce travail il est maintenant possible de cartographier les mouvements locaux et segmentaux de la chaine désordonnée des acides aminés formant la protéine en fonction de son environnement, plus ou moins visqueux, et à différentes températures. Ces nouvelles méthodes permettent d’accéder à la réalité de fonctionnement de ces protéines dans un milieu biologique, au sein de cellules vivantes par exemple, permettant de comprendre la dynamique fonctionnelle de ces protéines dans les conditions jusque-là peu accessibles.

A Unified Description of Intrinsically Disordered Protein Dynamics under Physiological Conditions using NMR Spectroscopy. Wiktor Adamski, Nicola Salvi, Damien Maurin, Justine Magnat, Sigrid Milles, Malene Ringkjøbing Jensen, Anton Abyzov, Christophe Moreau, Martin Blackledge. Journal of the American Chemical Society ; 141(44):17817-17829

Un candidat pour le développement de vaccins contre le VIH-1

La clef du développement d’un vaccin contre le VIH est l’induction d’anticorps neutralisants à large spectre (bnAb). Les classes de bnAb actuellement connues sont dirigées contre six régions fonctionnelles de la protéine d’enveloppe du VIH. Plusieurs bnAb puissants qui ciblent un épitope très conservé situé sur gp41 ont été identifiés. Des candidats pour le développement d’un vaccin basé sur des peptides mimant cet épitope ont été testés sans succès. Quelle est la raison de ces échecs ? Dans cette étude, les chercheurs du groupe EBEV de l’IBS et leurs collaborateurs ont caractérisé un nouveau bnAb humain très puissant (LN01) dirigé contre l’épitope MPER situé sur la protéine gp41 du VIH. LN01 neutralise 92% d’un panel de 118 souches virales. En examinant les détails moléculaires de la neutralisation du virus par l’anticorps LN01, les chercheurs ont montré que, en plus de l’épitope MPER, l’interaction de LN01 avec gp41 nécessite une partie de la région transmembranaire (TM) de gp41. Les études structurales menées ont permis d’élucider le rôle de cette région transmembranaire et l’importance de l’interaction de LN01 avec les lipides pour la neutralisation du virus. En s’appuyant également sur des études utilisant la simulation de dynamique moléculaire, les chercheurs proposent un modèle d’interaction de LN01 avec son épitope inséré dans la membrane virale (Figure). Toutes ces données démontrent qu’un candidat pour le développement de vaccins doit comprendre les domaines MPER et transmembranaire de gp41 correctement insérés dans une bicouche lipidique pour induire des anticorps neutralisants à large spectre puissants.

Structural basis for broad HIV-1 neutralization by the MPER-specific human Broadly neutralizing antibody LN01. Pinto D, Fenwick C, Caillat C, Silacci C, Guseva S, Dehez F, Chipot C, Barbieri S, Minola A, Jarrossay D, Tomaras GD, Shen X, Riva A, Tarkowski M, Schwartz O, Bruel T, Dufloo J, Seaman MS, Montefiori DC, Lanzavecchia A, Corti D, Pantaleo G and Weissenhorn W. Cell Host Microbe ; 26(5):623-637.e8.

Sigrid Milles (IBS/FDP) prix Paoletti 2019

Sigrid Milles a reçu, le 30 octobre 2019 au siège du CNRS, le Prix Paoletti 2019 pour son travail sur les protéines intrinsèquement désordonnées par fluorescence à molécules unique et résonance magnétique nucléaire (RMN). Détails.
Ce prix prestigieux, crée en mémoire de Claude Paoletti, ancien directeur scientifique du département des sciences de la vie du CNRS, récompense un jeune chercheur en biologie, toutes disciplines confondues.

Inauguration départementale de la fête la science 2019 sur le Campus EPN

Pour l’inauguration départementale de la fête de la science 2019, le Campus EPN a ouvert ses portes le 03 octobre matin avec des visites des plateformes Résonance Magnétique Nucléaire (RMN) et de microscopie électronique de l’IBS, du tunnel de l’ESRF, de la plateforme partenariale EMBL-IBS de cristallographie à haut-débit de protéines, du bâtiment des Sciences et de deux laboratoires communs ILL-ESRF.

La cérémonie de lancement a eu lieu à l’IBS en présence de Madame Chloé Lombard, représentant Monsieur le Préfet de l’Isère, de Madame Viviane Henry représentant Madame la Rectrice de l’Académie de Grenoble, de M.Christophe Ferrari, Président, Grenoble-Alpes-Métropole, de M.Eric Piolle, maire de Grenoble, et de Mme Jeany Jean-Baptiste, Directrice de la Casemate. Les Directeurs des 4 institutions présentes sur le Campus EPN (EBML, ESRF, IBS et IBS), ainsi que des porteurs de projet de la Fête de la Science issus d’autres laboratoires ou associations, étaient également présents.

Visite de la plateforme de Microscopie electronique de l’IBS - © IBS
Visite de la plateforme de RMN de l’IBS - © IBS
Visite du tunnel ESRF - © ESRF
Cérémonie de lancement - © ILL
M. Weissenhorn, directeur de l’IBS - © IBS
Mme Jeany Jean-Baptiste, Directrice de la Casemate - © IBS
M.Eric Piolle, maire de Grenoble - © IBS
M.Christophe Ferrari, Président, Grenoble-Alpes-Métropole - © IBS
Mme Viviane Henry représentant Madame la Rectrice de l’Académie de Grenoble - © IBS
Mme Chloé Lombard, représentant Monsieur le Préfet de l’Isère - © IBS

Ce fut une belle occasion de valoriser nos équipements de recherches coopératives et notre attachement à la promotion et à la diffusion de la science.
Retrouvez les actions menées par l’IBS pour la FDS 2019.

Des pseudo-adénovirus chimériques pour combattre les virus émergents

Les maladies infectieuses continuent de décimer les populations dans le monde entier. Parmi les moyens dont nous disposons pour contrer ces menaces, la vaccination s’est avérée exceptionnellement puissante. La variole a été éradiquée, la rougeole et la poliomyélite sont contrôlés par la vaccination. Cependant, de graves menaces pèsent toujours comme en témoignent les épidémies causées par les virus Ebola ou Zika. Un autre exemple récent est le virus Chikungunya, un pathogène viral transmis par la piqûre du moustique tigre. Autrefois confiné à l’Afrique subsaharienne, le virus Chikungunya s’est récemment répandu dans le monde entier depuis que ces moustiques vecteurs remontent géographiquement vers les pôles du fait du changement climatique.
L’équipe ‘Adénovirus’, du groupe Microscopie Electronique & Méthodes de l’IBS a constitué un consortium international avec l’EMBL et l’Université de Bristol pour imaginer une nouvelle technologie vaccinale. En effet, cette équipe travaille sur une protéine de l’adénovirus s’auto-assemblant spontanément par 60 pour donner une particule particulièrement stable même sans réfrigération ressemblant à un virus mais étant non infectieuse. Une étude par cryo-microscopie électronique a montré que cette particule possède une surface quasi-sphérique très flexible. Une ingénierie de cette protéine adénovirale a alors été menée pour remplacer à façon ces régions exposées par celles provenant d’autres pathogènes. Une preuve de principe a été établie en exprimant une particule affichant des épitopes neutralisants du virus Chikungunya. Ces néo-particules chimérique Adénovirus/Chikungunya ont donné des résultats prometteurs dans les études animales comme le montrent à la fois leur drainage vers les ganglions lymphatiques et la réponse humorale produite contre les épitopes du virus Chikungunya couvrant la particule. Cette technologie vaccinale simple d’emploi, basée sur une particule unique pouvant être modifiée par biologie synthétique a été brevetée par le CNRS et l’EMBL et pourrait à terme permettre de combattre de nombreuses autres maladies infectieuses. Les résultats viennent d’être publiés dans la prestigieuse revue ‘Science Advances’.

Synthetic self-assembling ADDomer platform for highly efficient vaccination by genetically encoded multiepitope display. Charles Vragniau, Joshua C. Bufton, Frédéric Garzoni, Emilie Stermann, Fruzsina Rabi,Céline Terrat, Mélanie Guidetti, Véronique Josserand, Matt Williams, Christopher J. Woods, Gerardo Viedma, Phil Bates, Bernard Verrier, Laurence Chaperot, Christiane Schaffitzel, Imre Berger and Pascal Fender. Science Advances ; Vol. 5, no. 9, eaaw2853

Détermination de la structure à résolution atomique d’un complexe enzymatique en combinant RMN et cryo-ME

Compte-tenu de leur complexité, la détermination de la structure des machineries biologiques de haut poids moléculaire reste souvent un défi pour chacune des méthodes expérimentales à la disposition des structuralistes. Les chercheurs des groupes MEM, NMR et DYNAMOP de l’IBS, en collaboration avec l’université de Francfort et du NIH, ont mis en place une approche intégrée permettant la détermination de la structure d’assemblages de protéines de haut poids moléculaire. Le protocole de calcul mis en place utilise simultanément les données structurales obtenues par RMN liquide et solide et par cryo-ME afin de surpasser les limites intrinsèques à chaque méthode structurale. Cette nouvelle approche intégrée a été appliquée pour déterminer la structure de l’aminopeptidase dodécamérique TET2 de 468kDa avec une précision supérieure à 1 Å, dépassant ainsi les normes actuelles de détermination de la structure des protéines par RMN et cryo-ME en termes de poids moléculaire et de précision. De plus cette nouvelle approche reste applicable dans les cas où seulement des données cryo-ME à résolution intermédiaire sont disponibles et ouvre ainsi de nouvelles perspectives pour résoudre la structure de systèmes biologiques complexes.

Integrated NMR and cryo-EM atomic-resolution structure determination of a half-megadalton enzyme complex. Gauto DF, Estrozi LF, Schwieters CD, Effantin G, Macek P, Sounier R, Sivertsen AC, Schmidt E, Kerfah R, Mas G, Colletier JP, Güntert P, Favier A, Schoehn G, Schanda P, Boisbouvier J. Nature Communications ;10(1):2697

La dynamique des résidus aromatiques d’une protéine de 0.5 MDa vue par RMN du solide

Les résidus aromatiques jouent des rôles clés dans beaucoup de protéines, et sont impliqués notamment dans les interactions protéine-ligand et protéine-protéine. Présents également dans leur cœur hydrophobe, les résidus aromatiques sont cruciaux pour la stabilité des protéines. Pour ces raisons, l’étude de leur dynamique peut donner des informations riches sur les mécanismes réactionnels et le repliement. Bien que des approches de RMN du liquide se soient intéressées aux résidus aromatiques depuis des décennies, ces études ont été limitées à des petites protéines. Une nouvelle approche développée par le groupe de RMN de l’IBS, en collaboration avec des chimistes japonais et autrichiens, permet d’étudier en détail les mouvements des résidus aromatiques même dans de très grandes protéines. L’approche combine la RMN du solide et un marquage isotopique spécifique des phénylalanines ou tyrosines. L’étude de Gauto et al a appliqué cette méthode à la protéine TET2, une enzyme de 468 kDa, et a mis en évidence, entre autres, la cinétique de rotation des phenylalanines dans une large gamme de temperatures, jusqu’à -170 °C, et un état conformationnel ‘excité’ autour d’un pore localisé entre sous-unités. Cette méthodologie permet également d’obtenir des contraintes structurales impliquant les résidus aromatiques, qui peuvent être utilisées à déterminer des structures de novo.

Aromatic Ring Dynamics, Thermal Activation, and Transient Conformations of a 468 kDa Enzyme by Specific 1H-13C Labeling and Fast Magic-Angle Spinning NMR. Gauto DF, Macek P, Barducci A, Fraga H, Hessel A, Terauchi T, Gajan D, Miyanoiri Y, Boisbouvier J, Lichtenecker R, Kainosho M, Schanda P. Journal of the American Chemical Society ; 141(28):11183-11195

Mécanisme d’activation allostérique d’une enzyme par un inhibiteur

La découverte qu’un inhibiteur active une enzyme semble contre-intuitive. Comment un inhibiteur, qui se lie au site actif, peut-il augmenter l’activité de l’enzyme ? Dans cette étude, des chercheurs de l’IBS (groupes RMN, MICA et PG), en collaboration avec des collègues de Nancy et de Saragosse, ont révélé comment la grande protéase ClpP de 300 kDa subit cette intrigante activation allostérique par un inhibiteur ainsi que par des substrats. Une approche multi-technique, impliquant la cristallographie aux rayons X, la RMN en solution et à l’état solide, des simulations de dynamique moléculaire et la calorimétrie, montre que la liaison sous-stoechiométrique d’inhibiteurs à quelques sites actifs modifie l’équilibre de cette protéine oligomèrique, et favorise, pour l’ensemble des sites actifs, un état étendu (ayant une plus grande activité). Les résultats pourraient fournir de nouvelles voies pour le développement de médicaments de cette cible potentielle de protéines antibiotiques.

Mechanism of the allosteric activation of the ClpP protease machinery by substrates and active-site inhibitors. Felix J, Weinhäupl K, Chipot C, Dehez F, Hessel A, Gauto DF, Morlot C, Abian O, Gutsche I, Velazquez-Campoy A, Schanda P, Fraga H. Science Advances ; Vol. 5, no. 9, eaaw3818

Morphologie cellulaire et dynamique des nucléoïdes chez D. radiodurans

Dans cet article, les chercheurs IBS de l’équipe Timmins (groupe VIC), en collaboration avec l’équipe Bourgeois (groupe DYNAMOP), ont mis en évidence l’organisation et la dynamique du nucléoïde de la bactérie radiorésistante, Deinococcus radiodurans, par des approches de microscopies de fluorescence conventionnelles et de super-résolution. Ces travaux ont révélé pour la première fois que les nucléoïdes bactériens sont des entités complexes qui changent de structure en fonction du cycle cellulaire et peuvent adopter des conformations plus ou moins compactes. La protéine HU semble jouer un rôle clé dans ce processus.

Cell morphology and nucleoid dynamics in dividing D. radiodurans. Floc’h K, Lacroix F, Servant P, Wong YS, Kleman JP, Bourgeois D and Timmins. Nature Communications ; 10(1):3815

Structure de la nucléocapside du virus Hantaan révélée à 3.3 Å de résolution par cryo-ME

Le virus Hantaan, qui appartient à la famille des Hantaviridae (ordre Bunyavirales) est transmis par les rongeurs. Il peut provoquer chez l’Homme des fièvres hémorragiques fatales contre lesquelles aucun traitement n’existe. Les segments génomiques de ce virus à ARN négatif sont entourés de multiples copies de la nucléoprotéine pour former des nucléocapsides hélicoïdales. Le groupe de Microscopie et Méthodes de l’IBS a utilisé les dernières avancées en cryo-microscopie électronique et a pu déterminer la structure à 3.3 Å de résolution d’une nucléocapside recombinante non pathogène. Cette structure a permis de révéler comment l’interaction entre les nucléoprotéines permet la formation d’un tunnel continu pouvant accueillir et protéger le génome. Ce travail a fortement bénéficié de la présence de la plateforme de cryo-microscopie électronique à l’IBS et du cryo-microscope électronique Titan Krios de l’ESRF.

High resolution cryo-EM structure of the helical RNA-bound Hantaan virus nucleocapsid reveals its assembly mechanisms. Arragain B, Reguera J, Desfosses A, Gutsche I, Schoehn G, Malet H. Elife ; 8. pii : e43075.

Importance de la structure tertiaire d’un lncRNA dans des processus cellulaires importants

Il existe plusieurs mécanismes cellulaires pour lutter contre le cancer. Un des acteurs majeurs est la protéine p53 qui, lorsqu’elle devient inactive, augmente fortement le risque de développement cancéreux. Maternally expressed 3 (MEG3), un ARN long non codant (lncRNA, > 500 kDa), est une autre molécule qui prévient le cancer de par son activité stimulatrice sur p53.
Les résultats d’une étude sur la structure de MEG3, publiés dans Molecular Cell, pourraient aider à faire progresser le diagnostic et le traitement de certains types de cancer. Elle a été dirigée par le groupe de Marco Marcia (EMBL, Grenoble) en collaboration avec l’équipe AFM de l’Institut de Biologie Structurale (IBS, Grenoble), le département CIBIO (University of Trento, Italie) et le Max Delbrück Center (Berlin, Allemagne).
Cette étude permet de démontrer que c’est au travers d’une structuration tridimensionnelle précise que MEG3 assure sa fonction cellulaire, notamment grâce à des structures d’ARN bien particulières connues sous le nom de « kissing loops ».
L’équipe AFM de l’IBS a déterminé par imagerie de molécules lncRNA uniques, la conformation de MEG3 dans plusieurs conditions expérimentales (natives, déstabilisantes, et dénaturantes). La figure ci-jointe fournit un échantillon de 100 molécules natives isolées de MEG3 déposées sur du mica et imagées à l’air par microscopie à force atomique (AFM) avec le mode Peak-Force. Par comparaison avec une imagerie AFM de molécules d’ARN non-structurées (poly-A) ou connues pour être structurées (intron de groupe II), les résultats démontrent la présence d’un repliement particulier pour MEG3 ce qui est en accord avec les résultats biochimiques et biophysiques de cette étude.

Conserved pseudoknots in lncRNA MEG3 are essential for stimulation of the p53 pathway. Uroda T, Anastasakou E, Rossi A, Teulon J-M, Pellequer J-L, Annibale P, Pessey O, Inga A, Chillon I and Marcia M. Mol. Cell 75 : 1-14.

Une stratégie pour réduire les intermittences de fluorescence en sptPALM

La microscopie super-résolution permet d’observer la matière vivante à l’échelle nanoscopique, non seulement d’un point de vue structural mais aussi d’un point de vue dynamique. Dans ce dernier cas, il s’agit le plus souvent de suivre des molécules cibles individuelles lorsqu’elles diffusent dans une cellule : c’est la technique « sptPALM » (single-particle-tracking localization microscopy). Cependant, un important obstacle à cette technique concerne l’imperfection des marqueurs fluorescents utilisés pour étiqueter les molécules cibles. Ces marqueurs sont le plus souvent des protéines fluorescentes photoconvertibles (PCFPs). Les PCFPs ont notamment une facheuse tendance à "clignoter", ie à s’éteindre de manière transitoire, ce qui fait rapidement perdre la trace des molécules individuelles.
Dans ce travail, réalisé en collaboration avec des chercheurs de l’Université Catholique de Leuven en Belgique, les chercheurs de l’équipe Pixel du groupe DYNAMOP de l’IBS ont étudié l’origine du phénomène de clignotement dans le cas de la protéine fluorescente photoconvertible « mEos4b ». Un état « noir » (non fluorescent) a été mis en évidence, et sa caractérisation détaillée a révélé une forte sensibilité à la lumière de couleur cyan. Ainsi une faible illumination de l’échantillon avec un laser à 488 nm dépeuple efficacement cet état noir, forçant un retour rapide vers l’état fluorescent et réduisant considérablement l’intensité du clignotement. En sptPALM, cette illumination additionnelle à 488 nm est très facile à réaliser, apportant une forte amélioration de la qualité des données avec un effort minimal.

Mechanistic investigation of mEos4b reveals a strategy to reduce track interruptions in sptPALM. De Zitter E, Thédié D, Mönkemöller V, Hugelier S, Beaudouin J, Adam V, Byrdin M, Van Meervelt L, Dedecker P and Bourgeois D. Nature Methods ; volume 16, pages707–710.

Mécanisme d’assemblage de pores sur la surface bactérienne : une stratégie pour secréter des toxines

Les bactéries ont développé différents systèmes de sécrétion qui leur permettent de secréter des toxines vers l’extérieur de la cellule. Ces machineries sont importantes pour les processus d’infection, colonisation et communication microbienne. Un élément important de plusieurs de ces machineries est la sécrétine, protéine membranaire qui forme un pore sur la surface bactérienne permettant la sortie des toxines. En utilisant les techniques de cryo-microscopie électronique, cristallographie, et génétique microbienne, les groupes MEM et PATBAC, en collaboration avec l’Université de Saskatchewan au Canada, ont résolu la structure (à environ 3,5 Å de résolution) de deux sécrétines des pathogènes émergeants Vibrio vulnificus et Aeromonas hydrophila et ont caractérisé le mécanisme d’assemblage de celles-ci sur la membrane bactérienne. Ce travail a montré que l’assemblage de certaines sécrétines nécessite l’aide de lipo-protéines membranaires appelées ‘pilotines’, tandis que d’autres s’assemblent d’une façon indépendante. L’interface sécrétine-pilotine étant essentielle pour la virulence de certains pathogènes, elle pourrait être une cible originale pour le développement de nouveaux inhibiteurs d’infections causées par les bactéries.

Structure and assembly of pilotin-dependent and -independent secretins of the Type II secretion system. Howard SP, Estrozi L, Contreras-Martel C, Bertrand Q, Job V, Martins A, Schoehn G, Dessen A. PLoS Pathogens ; 15(5):e1007731

Un double étiquetage pour faciliter l’étude des Glycosaminoglycanes

Les Héparanes sulfate (HS) sont des polysaccharides sulfatés de la famille des Glycosaminoglycanes qui participent à de nombreux processus cellulaires du fait de leur capacité à interagir et à moduler un large éventail de protéines de signalisation. Ces interactions font intervenir des motifs d’HS particuliers, définis par leur séquence saccharidique et leur profil de sulfatation. Cependant, les caractéristiques structurales de ces motifs fonctionnels demeurent la plupart du temps mal connues, du fait de la complexité moléculaire de ces polysaccharides et d’un manque d’outils dédiés à leur analyse.
Dans ce contexte, les chercheurs du groupe SAGAG, en collaboration avec l’Institut Parisien de Chimie Moléculaire et le laboratoire LG2A d’Amiens, ont développé une méthode permettant un double marquage des d’oligosaccharides d’HS, par addition de type Thia-Michael et incorporation de deutérium, respectivement aux niveaux des extrémités non-réductrices et réductrices du sucre. Cette nouvelle technique d’étiquetage permet de combiner un marquage d’oligosaccharide à l’échelle du microgramme et des analyses par spectrométrie de masse, tout en n’altérant pas les propriétés de reconnaissance HS/protéines, comme démontré pour les enzymes héparinase I et HSulf-2. Cette méthode constitue un nouvel outil qui devrait permettre de nouveaux développements pour le séquençage d’oligosaccharides de GAGs et l’élucidation de nouvelles relations structure/fonction.

A microscale double labelling of GAG oligosaccharides compatible with enzymatic treatment and mass spectrometry. Przybylski C, Bonnet V, Vivès RR. Chemical Communications ; 55(29):4182-4185.

Cibler des protéines de l’hôte pour lutter contre la grippe

De nouvelles stratégies thérapeutiques ciblant la grippe sont activement recherchées en raison des limites des médicaments actuellement disponibles, notamment les phénomènes de résistance spontanée. La thérapie dirigée contre l’hôte est un concept émergent visant à cibler certaines fonctions de l’hôte impliquées dans le cycle des pathogènes et/ou la pathogenèse, plutôt que cibler directement les composants propres de ces pathogènes. Dans cette optique, des chercheurs du groupe VRM, en collaboration avec l’Institut Pasteur, l’Université Paris Diderot et l’Université Paris Descartes ont focalisé leur attention sur un partenaire cellulaire essentiel à l’infection par les virus grippaux, le complexe d’épissage RED–SMU1. Combinant la cristallographie et la modélisation moléculaire, ils ont identifié des molécules synthétiques ciblant une interface essentielle à l’assemblage du complexe RED–SMU1. Ils ont notamment résolu la structure du domaine N-terminal de SMU1 en complexe avec RED mais aussi celle du même domaine lié à l’une des molécules identifiées pour perturber ce complexe. Ils ont de plus montré que ces composés inhibant l’interaction RED–SMU1, affectent l’épissage et la multiplication des ARNm viraux, tout en préservant la viabilité cellulaire. Leurs résultats démontrent le potentiel de molécules ciblant SMU1 en tant que thérapie antivirale, qui pourraient être actives contre un large éventail de virus grippaux mais aussi être moins sujettes à la pharmacorésistance.

Destabilization of the human RED–SMU1 splicing complex as a basis for host-directed antiinfluenza strategy. Ashraf U, Tengo L, Le Corre L, Fournier G, Busca P, McCarthy AA, Rameix-Welti M-A, Gravier-Pelletiere C, Ruigrok RW, Jacob Y, Vidalain P-O, Pietrancosta N, Crépin T, Naffakh N. Proc Natl Acad Sci USA ;116(22):10968-10977.

Comment les virus se libèrent des cellules après les avoir infectées

De nombreux processus cellulaire tels que le bourgeonnement des virus enveloppés et la cytokinèse nécessitent un remodelage important des membranes cellulaires. Ces modifications de la structure de la membrane sont catalysées par une machinerie appelée endosomal sorting complex required for transport (ESCRT). La famille de protéine ESCRT-III s’assemble en structures, observées in vivo et in vitro, en forme de spirales ou tubes situées sur la surface intérieure de la membrane. Les complexes ESCRT-III sont situés, par exemple, à l’intérieur du bout de membrane qui sépare un virus enveloppé en train de bourgeonner de la cellule à laquelle il est toujours attaché. Afin de libérer le virus, ce bout de membrane doit être coupé. Dans cette étude les chercheurs du groupe "Entrée et bourgeonnement des virus enveloppés", en collaboration avec l’Université de Groeningen, ont étudié in vitro la constriction de tubes ESCRT-III par la AAA ATPase VPS4B. Pour ce faire, ils ont utilisé la microscopie à force atomique pour suivre la constriction de ces tubes en temps réel couplée à la microscopie électronique pour avoir des informations sur la structure à plus haute résolution. Leurs résultats montrent que la constriction des tubes décroit progressivement le diamètre des tubes pour finalement les couper en deux de façon asymétrique avec une des extrémités qui adopte une forme de dôme. Ils émettent l’hypothèse que la constriction du diamètre de ces tubes et la formation de ces structures en forme de dômes contraignent la membrane afin de permettre la fission membranaire.

VPS4 triggers constriction and cleavage of ESCRT-III helical filaments. Maity S, Caillat C, Miguet N, Sulbaran G, Effantin G, Schoehn G, Roos WH, Weissenhorn W. Science Advances ;5(4):eaau7198

Martin Blackledge, lauréat d’une prestigieuse bourse européenne « ERC Advanced » 2019

Le Conseil européen de la recherche (European Research Council , ERC) vient de décerner une bourse "Advanced Grant" à Martin Blackledge, chercheur de l’Institut de Biologie Structurale de Grenoble (IBS - unité mixte de recherche CEA/CNRS/UGA), dans le cadre d’un projet visant à étudier les assemblages moléculaires très dynamiques et leur role dans la replication des virus.

Martin Blackledge est chef du groupe FDP et directeur adjoint de l’IBS. Son projet, intitulé « DynamicAssemblies » a reçu un soutien financier de la part de l’ERC qui s’élève à 2.5M € sur 5 ans. L’excellence scientifique au niveau européen est l’un des principaux critères de sélection de ces bourses qui doivent permettre à des scientifiques confirmés de proposer un sujet en rupture par rapport à leurs activités de recherche, tout en restant actifs au niveau scientifique.

Martin Blackledge a étudié la physique à l’Université de Manchester et a obtenu son doctorat (D. Phil) en 1987 sous la direction du professeur George Radda de l’Université d’Oxford. Il a commencé à travailler sur la RMN, en développant des méthodes de spectroscopie RMN in vivo. En 1989, il reçut une bourse de la Royal Society pour travailler à l’ETH de Zurich sous la supervision du professeur Richard Ernst (prix Nobel de chimie 1991) où il a commencé à mettre au point des méthodes pour étudier la dynamique biomoléculaire par RMN. Ayant découvert la beauté des Alpes, il a décidé de poursuivre ses travaux à l’Institut de Biologie Structurale de Grenoble, où il dirige depuis 2007 le groupe « Flexibilité et Dynamique des Protéines par RMN ».

Son groupe de recherche s’intéresse principalement à l’étude de la dynamique des protéines par RMN, souvent associée à des techniques biophysiques complémentaires et à la simulation moléculaire avancée, afin de caractériser le rôle de la flexibilité conformationnelle dans la fonction biologique. Il a publié plus de 200 articles dans ce domaine. Récemment, son groupe a utilisé ces techniques pour décrire des protéines hautement flexibles ou intrinsèquement désordonnées, pour cartographier leurs trajectoires d’interaction à résolution atomique et pour déterminer la relation entre leur comportement dynamique et leur mécanisme fonctionnel.

En quoi consiste le projet « DynamicAssemblies » ?

Les protéines intrinsèquement désordonnées (PIDs) sont présentes dans tous les protéomes connus, jouant un rôle important dans les mécanismes fonctionnels dans tous les aspects de la biologie. De nombreux assemblages moléculaires comprennent des composants hautement dynamiques et fonctionnellement essentiels. La description de tels complexes hautement désordonnés à une résolution atomique et résolue dans le temps, est extrêmement difficile, nécessitant la mise au point de méthodologies adaptées.
Le projet décrira en particulier le comportement structurel et dynamique des machines de réplication virale hautement désordonnées, leur cinétique d’interaction avec l’hôte et les partenaires viraux, les effets des modifications post-traductionnelles, leur assemblage et leurs mécanismes fonctionnels. Le projet permettra également d’identifier le rôle de ces protéines dans la séparation de phase et la formation d’organelles fonctionnelles sans membrane.
La spectroscopie RMN est un outil extrêmement sensible pour l’étude de systèmes moléculaires hautement dynamiques, permettant la caractérisation précise de la dynamique conformationnelle à longue portée et locale des PIDs et de leurs complexes, à une résolution atomique. Le développement de méthodes basées sur la RMN, combiné aux progrès de la spectroscopie de fluorescence, la cryo-microscopie électronique et la diffusion aux petits angles, soutenu par des développements parallèles en simulation moléculaire, fournira les outils essentiels pour étudier les mécanismes fonctionnels de ces complexes jusque-là inaccessibles.

Mots clés
Dynamique des protéines, RMN, protéines intrinsequement désordonnées, paramyxoviruses, rougeole, nucléocapside, auto-assemblage, simulation par dynamique moléculaire, fluorescence

Montant
2.5M € sur 5 ans

La structure des nucléocapsides de la rougeole visualisée en haute résolution

Le virus de la rougeole est un pathogène humain extrêmement contagieux. La maladie provoquée par ce virus connait actuellement une résurgence très forte dans beaucoup de pays du monde, dont la France. La réplication de ce virus nécessite l’encapsidation du génome à ARN par la nucléoprotéine virale dans des supra structures moléculaires nommées les nucléocapsides. Les chercheurs de l’IBS ont développé des méthodes expérimentales (1) pour encapsider un ARN particulier in vitro, permettant ainsi la détermination de la structure tridimensionnelle à haute résolution (3.3Å) de ces nucléocapsides (NCs) par cryo-microscopie électronique (2). Cette structure révèle les positions et la nature des interactions fines entre l’ARN et la nucléoprotéine. L’identification des acides aminés qui sont essentiels à l’encapsidation permet de mieux comprendre comment la polymérase à ARN du virus va pouvoir répliquer le virus.

1) Self-assembly of measles virus nucleocapsid-like particles : Kinetics and RNA sequence dependence. Milles, Jensen, Communie, Maurin, Schoehn, Ruigrok, Blackledge. Angew Chem Int Ed 55, 9356 (2016)

2) Assembly and cryo-EM structures of RNA-specific measles virus nucleocapsids provide mechanistic insight into paramyxoviral replication. Desfosses A, Milles S, Jensen MR, Guseva S, Colletier JP, Maurin D, Schoehn G, Gutsche I, Ruigrok RWH, Blackledge M. Proc Natl Acad Sci U S A. ; doi : 10.1073/pnas.1816417116.

Les secrets intimes de la photosymbiose dans le plancton marin

La photosymbiose entre une cellule hôte et des microalgues intracellulaires est fréquente dans le plancton océanique. Cependant, le fonctionnement de cette interaction et les mécanismes subcellulaires impliqués restait énigmatiques. Grâce à une combinaison de techniques d’imagerie notamment développées à Grenoble, les chercheurs viennent de montrer que l’organisation structurelle, la physiologie et l’état trophique des microalgues (les haptophytes Phaeocystis) changent considérablement lorsqu´elles sont en symbiose dans un hôte (acanthaires), par rapport à leur état libre en culture. En symbiose, la division cellulaire des algues est bloquée, la photosynthèse est améliorée et le volume cellulaire est multiplié par 10 avec un nombre plus élevé de chloroplastes (de 2 à 30) et de membranes thylakoïdes. Cette étude dévoile une transformation morphologique et métabolique sans précédent des microalgues après leur intégration dans un hôte, et suggère que cette symbiose correspond davantage à une stratégie de « culture » d’algues par l’acanthaire qu’à un véritable apport mutuel entre les deux espèces.

La plateforme de microscopie électronique de l’IBS-ISBG a été impliquée dans la préparation des échantillons de plancton et de cultures de microalgues pour l’imagerie en microscopie électronique et imagerie chimique. Un protocole spécifique a également été mis au point pour permettre de corréler les imageries structurales (TEM, SEM, FIB-SEM) avec l’imagerie chimique (microscopie de fluorescence-X, SIMS).

Ces résultats ont été publiés le 28 février dans la revue scientifique Current Biology et ont fait l’objet d’un communiqué de presse.

Algal Remodeling in a Ubiquitous Planktonic Photosymbiosis. Decelle J, Stryhanyuk H, Gallet B, Veronesi G, Schmidt M, Balzano S, Marro S, Uwizeye C, Jouneau PH, Lupette J, Jouhet J, Maréchal E, Schwab Y, Schieber NL, Tucoulou R, Richnow H, Finazzi G, Musat N. Current Biology ; doi : 10.1016/j.cub.2019.01.073

Décryptage moléculaire d’une étape clé du processus de maturation des héparanes sulfates

Les héparanes sulfates appartiennent à la famille des glycosaminoglycanes, des polysaccharides chargés négativement, présents en grande quantité sur les surfaces cellulaires et dans les tissus interstitiels. Ils exercent leurs activités en interagissant avec de très nombreuses protéines dont ils contrôlent le mécanisme d’action, intervenant ainsi dans la plupart des grandes fonctions biologiques (morphogénèse, division, signalisation et migration cellulaire, inflammation et réponses immunitaires, angiogenèse et réparation tissulaire ….etc) ainsi que dans leurs disfonctionnements pathologiques. Ces polysaccharides sont constitués de motifs glycaniques variés, constituant les zones de reconnaissances des protéines liant les héparanes sulfates et sont essentielles pour « coder » les diverses fonctions biologiques de la molécule. Les mécanismes moléculaires associés à la biogénèse de ces domaines restent très mal documentés.
Un travail collaboratif associant le laboratoire Architecture et Fonction des Macromolécules Biologiques, l’Institut de Biologie Structurale et l’Institut de Chimie Moléculaire et des Matériaux d’Orsay, a permis de décrire le mode d’action à l’échelle atomique d’une enzyme clé de la biogénèse des héparanes sulfates, la C5-épimérase. Cette enzyme a pour spécificité de convertir les acides glucuroniques (GlcA) en acides iduroniques (IdoA). Cette fonction est essentielle au processus de maturation des héparanes sulfate puisque les acides iduroniques sont systématiquement présents dans les sites d’interaction du polysaccharide. En combinant des approches d’ingénierie et de chimie des polysaccharides, de biochimie des protéines et de biologie structurale (cristallographie aux rayons X), les résidus formant le site catalytique de l’enzyme ont été identifiés ainsi que les modes de liaison du substrat et du produit. Le mécanisme d’action de l’enzyme met en jeu des changements conformationnels du polysaccharide, associés à des distorsions sélectives de l’entité glucuronique devant être épimérisée.
Ces résultats fournissent les bases moléculaires et mécanistiques pour la mise en place de nouvelles stratégies visant à modifier les résidus d’acide glucuronique/iduronique au niveau même du polymère et de générer, par synthèse chimio-enzymatique, des analogues d’héparanes sulfate pour des applications biotechnologiques ou thérapeutiques.

Substrate binding mode and catalytic mechanism of human heparan sulfate D-glucuronyl C5 epimerase. Debarnot C, Monneau Y R, Roig-Zamboni V, Delauzun V, Le Narvor C, Richard E, Hénault J, Goulet A, Fadel F, Vivès R R, Priem B, Bonnaffé D, Lortat-Jacob H, Bourne Y. Proc Natl Acad Sci USA published ahead of print March 14, 2019 https://doi.org/10.1073/pnas.1818333116

Le ciblage d’un virus développé en thérapie du cancer élucidé à l’échelle atomique

Les adénovirus causent des maladies qui peuvent s’avérer parfois fatales. En les modifiant, ils peuvent également devenir de redoutables tueurs de cellules cancéreuses. Les adénovirus sont à ce jour les vecteurs les plus utilisés dans les essais cliniques chez l’homme. Des chercheurs de l’IBS viennent d’élucider par cryo-microscopie électronique le mécanisme permettant à des adénovirus de se fixer à la surface des cellules. Ces résultats, publiés dans la revue Nature Communication le 12 mars 2019, pourraient ouvrir la voie au développement de vecteurs anti-tumoraux de nouvelle génération. Détails

Cryo-EM structure of adenovirus type 3 fibre with desmoglein 2 shows an unsual mode of receptor engagement. Vassal-Stermann E, Effantin G, Zubieta C, Burmeister W, Iséni F, Wang H, Lieber A, Schoehn G, Fender P. Nature Communications in press, (2019)

Un simple électron à l’origine de l’adaptation des bactéries

Si le Vivant est composé essentiellement de matière organique, près de 40 % des protéines ne fonctionnent que parce qu’elles fixent un ou plusieurs ions métalliques, permettant ainsi des réactions d’une très grande importance pour la vie cellulaire. Des chercheurs de l’IBS ont déterminé la structure de la métalloprotéine RsrR comportant un centre (Fe-S), présente chez les bactéries. Leurs résultats, parus dans JACS, expliquent comment RSrR participe au contrôle de l’accès au génome de la cellule, permettant, ou non, l’expression de certains gènes. Détails

The Crystal Structure of the Transcription Regulator RsrR Reveals a [2Fe-2S] Cluster Coordinated by Cys, Glu and His Residues. Volbeda A, Pellicer Martinez MT, Crack JC, Amara P, Gigarel O, Munnoch JT, Hutchings MI, Darnault C, Le Brun NE, Fontecilla-Camps JC. J Am Chem Soc. 2019 Jan 18. doi : 10.1021/jacs.8b10823.

Un nouvel éclairage sur les mécanismes de reconnaissance des Héparanes sulfate par les sulfatases SULFs

Grâce à leur capacité de modifier le degré de 6-O-sulfatation des polysaccharides complexes de type héparane sulfate (HS), les endosulfatases extracellulaires de la famille des Sulfs constituent des régulateurs majeurs de nombreux processus biologiques, dont la progression tumorale. Cependant, malgré un intérêt croissant, l’étude des Sulfs a été considérablement freinée par un accès limité à ces enzymes sous forme recombinante. Dans cette étude, les chercheurs du groupe SAGAG de l’IBS et leurs collaborateurs ont mis en place un nouveau système d’expression et de purification efficace de l’enzyme humaine HSulf-2 en cellules HEK293 de mammifères. Cette nouvelle source de protéine leurs a permis d’étudier le rôle de ses différents domaines fonctionnels pour son activité. Par des approches de mutagénèse dirigée, ils ont confirmé des études antérieures montrant que le domaine catalytique (CAT) de HSulf-2 était suffisant pour induire une activité de type arylsulfatase, mais que son domaine hydrophile (HD) était nécessaire à l’activité 6-O-endosulfatase de l’enzyme sur les HS. Enfin, nous avons démontré pour la première fois que la fixation à haute affinité de chaînes d’HS substrats à l’enzyme impliquait l’action coordonnée de ces deux domaines, et ils onts identifié et caractérisé 2 nouveaux sites de liaison aux HS dans le domaine CAT. Ces travaux contribuent ainsi à mieux comprendre les mécanismes moléculaires régissant la reconnaissance Enzyme/substrat de HSulf-2. De plus, l’accès à cette enzyme sous forme recombinante ouvre de nouvelles perspectives pour de futures études structurales, ainsi que le développement d’inhibiteurs spécifiques des Sulfs.

Expression and purification of recombinant extracellular sulfatase HSulf-2 allows deciphering of enzyme sub-domain coordinated role for the binding and 6-O-desulfation of heparan sulfate. Seffouh A, El Masri R, Makshakova O, Gout E, Hassoun ZEO, Andrieu JP, Lortat-Jacob H, Vivès RR. Cell. Mol. Life Sci. (2019).https://doi.org/10.{{1007/s00018-019-03027-2

Un nouveau microscope électronique à l’IBS : le Glacios

Un nouveau microscope électronique a été livré à l’IBS le 07 décembre 2018 en remplacement du microscope électronique Polara. Ce microscope électronique, un Glacios de la marque ThermoFisher, a été financé par le CEA, le CNRS, l’ESRF et FRISBI.
Le Glacios est un microscope électronique ultra stable de dernière génération, 200 kV, FEG, équipé d’un système de chargement automatique d’échantillons, d’un système porte grille compatible avec les microscopes Krios, d’une caméra à détection directe d’électrons Falcon II couplée à un système automatique de prise de vue et d’une caméra CMOS CETA. La caméra à détection directe d’électrons K2 Summit déjà en notre possession sera également réinstallée sur ce microscope prochainement et le fonctionnement de la caméra CETA améliorée par l’installation de l’option « SPEED ». Grâce à ce microscope, nous pourrons collecter des données à haute résolution mais également cribler différentes grilles et choisir la meilleure avant de la transférer éventuellement vers un microscope encore plus puissant de type Krios. C’est pour cette dernière option et dans le cadre de la collaboration étroite que nous entretenons avec l’ESRF que ce dernier aura accès au microscope Glacios. Ce microscope sera utilisé en imagerie cryo classique « particules isolées », en cryo tomographie et, grâce à l’option speed de la caméra CETA, pour optimiser les conditions de congélation/collecte en micro diffraction électronique.
L’installation du microscope a eu lieu en décembre et les tests de performance en janvier. Le Glacios sera accessible en mode service en mars. Ce microscope, comme le Polara, sera accessible directement, via Instruct ou FRISBI pour les utilisateurs nationaux ou internationaux.

Contacts : G. Schoehn et E. Neumann pour la plateforme de microscopie électronique de l’ISBG/IBS, ibs-plateforme-em.contact@ibs.fr.