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Institut de Biologie StructuraleGrenoble / France

Une stratégie pour réduire les intermittences de fluorescence en sptPALM

La microscopie super-résolution permet d’observer la matière vivante à l’échelle nanoscopique, non seulement d’un point de vue structural mais aussi d’un point de vue dynamique. Dans ce dernier cas, il s’agit le plus souvent de suivre des molécules cibles individuelles lorsqu’elles diffusent dans une cellule : c’est la technique « sptPALM » (single-particle-tracking localization microscopy). Cependant, un important obstacle à cette technique concerne l’imperfection des marqueurs fluorescents utilisés pour étiqueter les molécules cibles. Ces marqueurs sont le plus souvent des protéines fluorescentes photoconvertibles (PCFPs). Les PCFPs ont notamment une facheuse tendance à "clignoter", ie à s’éteindre de manière transitoire, ce qui fait rapidement perdre la trace des molécules individuelles.
Dans ce travail, réalisé en collaboration avec des chercheurs de l’Université Catholique de Leuven en Belgique, les chercheurs de l’équipe Pixel du groupe DYNAMOP de l’IBS ont étudié l’origine du phénomène de clignotement dans le cas de la protéine fluorescente photoconvertible « mEos4b ». Un état « noir » (non fluorescent) a été mis en évidence, et sa caractérisation détaillée a révélé une forte sensibilité à la lumière de couleur cyan. Ainsi une faible illumination de l’échantillon avec un laser à 488 nm dépeuple efficacement cet état noir, forçant un retour rapide vers l’état fluorescent et réduisant considérablement l’intensité du clignotement. En sptPALM, cette illumination additionnelle à 488 nm est très facile à réaliser, apportant une forte amélioration de la qualité des données avec un effort minimal.

Mechanistic investigation of mEos4b reveals a strategy to reduce track interruptions in sptPALM. De Zitter E, Thédié D, Mönkemöller V, Hugelier S, Beaudouin J, Adam V, Byrdin M, Van Meervelt L, Dedecker P and Bourgeois D. Nature Methods ; volume 16, pages707–710.