IBS - Institut de Biologie Structurale - Grenoble / France

Contrôle de la BER dans le paysage chromatinien

VAUCLARE Pierre — 2025-09-11T12:13:09Z

Projet de recherche
Nous nous intéressons à l'étude des mécanismes de régulation de la réparation par excision de bases (BER) au sein du noyau.
Plus particulièrement, nous utilisons des modèles de lignées humaines pour (i) caractériser, par spectrométrie de masse, les partenaires d'interaction et les modifications post-traductionnelles (PTMs) des facteurs de réparation impliqués dans la BER, et (ii) analyser leur distribution ainsi que leur mobilité grâce à la microscopie de super-résolution de type SMLM.
Ces approches combinées nous permettront de mieux comprendre l'organisation spatiale et dynamique des acteurs de la BER dans le noyau, d'élucider les mécanismes régulateurs qui conditionnent son efficacité et d'identifier de nouveaux facteurs contribuant à la réponse cellulaire face aux dommages oxydatifs ou alkylants.

Membres de l'équipe
Elise Pouponnot (PhD student)
Mrinalini Lianne Rao (PhD student)
Pierre Caron (CRCN, CNRS)
Fabienne Hans (Enseignante-chercheuse UGA)

Plateforme
Plateforme d'imagerie de l'IBS M4D

Collaborations
. Yohann Couté - EDyP Lab - CEA-IRIG, Grenoble, France

Publications

Les secrets de la division de D. radiodurans

VAUCLARE Pierre — 2025-09-08T12:57:53Z

La septation de D. radiodurans observée par imagerie de fluorescence 3D et cryo-tomographie électronique sur lamelles de cellules

Contrairement à la plupart des bactéries, Deinococcus radiodurans se divise selon un mécanisme dit de « portes coulissantes ». Au lieu que la paroi cellulaire se referme comme un iris tout autour de la périphérie de la cellule, deux nouvelles parois cellulaires à bords plats se développent vers l'intérieur à partir des côtés opposés de la cellule, se rencontrant et fusionnant au milieu de la cellule. Afin d'élucider les mécanismes moléculaires sous-jacents à ce processus de division inhabituel, nous avons collaboré avec les groupes MICA et PG de l'IBS et combiné des approches d'imagerie de pointe. La microscopie de fluorescence sur cellules vivantes réalisée sur la plateforme d'imagerie M4D nous a permis d'observer la division des cellules en temps réel, tandis que la cryo-tomographie électronique réalisée sur de fines lamelles congelées de la bactérie a révélé divers intermédiaires de la division cellulaire et la fine architecture de la paroi cellulaire à chaque étape du processus. Cette puissante combinaison a permis de découvrir la structure complexe en couches de l'enveloppe de la bactérie et de montrer comment les septa ou « portes coulissantes » se développent, se redressent et fusionnent.

Une découverte frappante a été la présence de fines protubérances membranaires à l'extrémité des septa en croissance. Une autre découverte importante a été la présence d'une structure à double arche à l'extrémité des septa comportant une couche épaisse et rigide de peptidoglycane, correspondant à FtsZ et FtsA, deux acteurs clés de la division cellulaire bactérienne. Ces résultats suggèrent que la paire FtsA/FtsZ joue un rôle important dans la rigidification des septa en régulant l'emplacement du mécanisme de synthèse du peptidoglycane avec lequel elle interagit.

Publications

Gaifas L, Kleman JP, Lacroix F, Schexnaydre E, Trouvé J, Morlot C, Sandblad L, Gutsche I & Timmins J. Combining live cell fluorescence imaging with in situ cryo-electron tomography sheds light on the septation process in Deinococcus radiodurans. Proc. Nat. Acad. Sciences (2025) DOI : 10.1073/pnas.2425047122

La division cellulaire chez D. radiodurans

VAUCLARE Pierre — 2025-09-08T12:31:27Z

Comment les bactéries se divisent-elles ? À première vue, cela peut sembler simple : une cellule se divise en deux. Mais derrière ce processus universel se cache une diversité fascinante de stratégies, façonnées par l'évolution, la morphologie bactérienne et l'environnement.

Deinococcus radiodurans se développe sous forme de diades (unité de deux cellules) et se divise pour former une tétrade (unité de quatre cellules), qui se sépare rapidement en deux diades. Cependant, contrairement à la plupart des bactéries, D. radiodurans se divise à l'aide d'un mécanisme inhabituel appelé « porte coulissante ». Ce mode de division avait été décrit dans les premières études sur la morphologie de D. radiodurans, et lorsque nous avons commencé nos expériences d'imagerie par fluorescence à l'aide du colorant membranaire Nile Red, nous avons également observé ce mode de division intrigant dans lequel les cellules se divisent par la synthèse de deux parois transversales opposées qui se rencontrent et fusionnent au milieu de la cellule. Afin d'élucider les mécanismes moléculaires sous-jacents à ce processus de division inhabituel, nous avons fait équipe avec les groupes MICA et PG de l'IBS et combiné des approches d'imagerie de pointe pour élucider la composition exacte des couches composant l'enveloppe complexe de la bactérie et montrer comment les septa « portes coulissantes » se développent, se redressent et fusionnent (voir le fait marquant).

Cette étude est importante non seulement parce qu'elle révèle comment l'une des bactéries les plus résistantes de la planète orchestre son processus de division, mais aussi parce qu'elle pourrait inspirer de nouvelles stratégies pour lutter contre les microbes et la menace croissante de la résistance aux antibiotiques. Elle ouvre également de nouvelles perspectives de recherche passionnantes, offrant la possibilité d'explorer plus avant le lien complexe entre la division cellulaire et la ségrégation des chromosomes.

Collaborations

Irina Gutsche (MICA group, IBS)
Cécile Morlot (PG group, IBS)

Publications

Gaifas L, Kirschner AM, Timmins J, and Gutsche I. Blik is an extensible 3D visualisation tool for the annotation and analysis of cryo-electron tomography data. PLOS Biology (2024). DOI : 10.1371/journal.pbio.3002447
Gaifas L, Kleman JP, Lacroix F, Schexnaydre E, Trouvé J, Morlot C, Sandblad L, Gutsche I & Timmins J. Combining live cell fluorescence imaging with in situ cryo-electron tomography sheds light on the septation process in Deinococcus radiodurans. Proc. Nat. Acad. Sciences (2025) DOI : 10.1073/pnas.2425047122

Jason Vanstaevel

VAUCLARE Pierre — 2025-09-08T12:20:14Z

Je suis doctorant dans l'équipe GenOM et travaillant sur la voie de réparation de l'ADN par excision de base. Pour ma thèse, j'étudie l'interaction entre APE1, une protéine de réparation de l'ADN et NPM1, la nucléophosmine 1, dans le but de comprendre ce mécanisme aidant à la préservation de l'intégrité du génome humain. Cependant, cette interaction est détournée par certains types de cancers afin de résister aux traitements anti-cancéreux et d'assurer leur prolifération. Lors de mon doctorat, j'ai pour objectif de décrire la structure du complexe formé lors de l'interaction entre APE1 et NPM1 en utilisant plusieurs techniques comme la microscopie électronique à température cryogénique (Cryo-EM) et la résonance magnétique nucléaire (RMN) mais aussi de réaliser la caractérisation biophysique de l'interaction.

Durant ma licence de biochimie, j'ai découvert la biologie structurale et j'ai cherché un master dans ce domaine où j'y ai développé un intérêt pour les protéines comme NPM1.

Harald Bernhard

VAUCLARE Pierre — 2024-09-05T07:18:49Z

Harald Bernhard
Post-doctorant, CNRS
Tél : +33 (0)4 57 42 87 37
Email : harald.bernhard@ibs.fr

Au cours de mes études en biologie moléculaire et biochimie à l'Université de Graz, j'ai développé un fort intérêt pour la biologie structurale, ce qui m'a amené à participer à plusieurs projets axés sur la cristallographie aux rayons X. Mon travail de doctorat (effectué à l'EMBL Grenoble) s'est appuyé sur cet intérêt, où j'ai utilisé la cryo-EM à particule unique combinée à des méthodes biochimiques pour caractériser les protéines du parasite Trypanosoma brucei.
À l'IBS, j'utilise actuellement la cryo-EM à particule unique et la tomographie cryo-électronique pour étudier l'organisation du nucléoïde et la division cellulaire chez Deinococcus radiodurans. Les bactéries sont fréquemment soumises à des stress environnementaux tels que le rayonnement UV, les fluctuations de température et les changements de pH, ce qui nécessite des mécanismes de réponse rapides et adaptatifs pour survivre. L'une des stratégies les plus efficaces consiste à réorganiser l'ensemble du génome, où les protéines associées aux nucléoïdes (NAP), régulières et induites par le stress, jouent un rôle essentiel dans l'organisation et l'empaquetage de l'ADN génomique. Nous utilisons Deinococcus radiodurans comme organisme modèle et explorons sa remarquable résistance aux radiations ionisantes et étudions sa réponse cellulaire au stress.

Pierre Caron

VAUCLARE Pierre — 2024-09-05T07:12:40Z

Pierre Caron
Chercheur CNRS, CRCN
Tel : +33 (0)4 57 42 85 66
email : pierre.caron@ibs.fr

Mes recherches portent sur l'étude des mécanismes de réparation de l'ADN en réponse à des agents génotoxiques et à des molécules thérapeutiques anticancéreuses. Au cours de mon doctorat et de mes travaux post-doctoraux, j'ai utilisé des modèles cellulaires innovants combinés à un large éventail de techniques pour induire des dommages à l'ADN. J'ai pu ainsi décrypter des mécanismes clés impliqués dans la maintenance de la chromatine et dans la régulation des événements de réparation de l'ADN dans le contexte de la chromatine.
En 2024, j'ai rejoint le laboratoire de Joanna Timmins à l'Institut de biologie structurale (IBS) pour continuer à explorer la réparation de l'ADN au sein de l'espace nucléaire. Grâce à l'expertise du laboratoire et à l'environnement unique offert par l'IBS et le campus de l'IRIG, je développe et utilise des approches avancées en protéomique et en microscopie pour caractériser et cartographier les mécanismes de réparation de l'ADN dans différentes régions du génome en réponse à divers agents génotoxiques et composés anticancéreux. Ce travail permettra de mieux comprendre les mécanismes qui régulent la stabilité de notre génome ; et, nous l'espérons, d'identifier de nouvelles cibles thérapeutiques anticancéreuses et de développer une médecine personnalisée en aidant à prédire la réponse des patients aux thérapies en fonction de leurs caractéristiques génétiques.

Remodelage du nucleoïde et variation de la dynamique de la proteine HU chez Deinococcus radiodurans en réponse au stress

VAUCLARE Pierre — 2024-09-02T11:54:56Z

La réorganisation du nucléoïde est une stratégie commune de réponse au stress chez les bactéries afin de protéger leur patrimoine génétique. Ce processus est régulé par de petites protéines, les NAPs (Nucleoid-Associated Proteins), qui interagissent avec l'ADN et jouent un rôle clé dans l'organisation et la régulation du génome bactérien.
Par des approches de microscopie avancée conventionnelle et de super-résolution, nous avons récemment montré que l'exposition aux rayons UV-C ou l'entrée en phase stationnaire induit de profonds changements morphologiques et de volume du nucléoïde de Deinococcus radiodurans, ainsi que des modifications de la mobilité de la protéine HU, principale NAP de cette bactérie. Bien que ces deux stress provoquent une rapide compaction du nucléoïde, la diffusion de HU diminue en phase stationnaire alors qu'elle augmente suite aux UV-C, suggérant des mécanismes sous-jacents distincts.
De plus, nous avons montré que l'exposition aux UV-C entraine une réorganisation des nucléoïdes en trois étapes : une condensation rapide avec une augmentation de la diffusion de HU (sans doute induite par le relargage de HU de l'ADN génomique), suivie d'une décompaction plus lente pour restaurer la morphologie normale du nucléoïde accompagnée d'un retour à la normale de la mobilité de HU (associé au réassemblage de HU sur l'ADN génomique), avant enfin la reprise de la croissance et de la division cellulaire. Ces observations illustrent la diversité et complexité des processus de remodelage des nucléoïdes et représentent une première étape vers la compréhension des mécanismes impliqués et notamment du rôle clé de HU dans ce processus.

Aperçu des fonctions du domaine N-terminal flexible et du cluster [4Fe-4S] de la NTH1 humaine

VAUCLARE Pierre — 2022-11-30T09:33:10Z

L'endonucléase III humaine ou hNTH1 est une enzyme contenant un groupe FeS, qui reconnaît et élimine les pyrimidines oxydées de l'ADN. Contrairement à ses homologues bactériens, hNTH1 possède une extension N-terminale de 100 acides aminés impliquée dans son adressage vers le noyau et la mitochondrie et dans la régulation de son activité catalytique par des interactions protéine-protéine. La structure cristalline d'une construction de hNTH1 tronquée en N-terminale a récemment été déterminée, confirmant la flexibilité intrinsèque de l'extension N-terminale et révélant une nouvelle conformation " ouverte " pour la région catalytique.

Dans ce travail, nous avons réalisé une étude biophysique comparative de la hNTH1 complète et d'une hNTH1 tronquée au niveau de l'extrémité N-terminale contenant uniquement le domaine catalytique, similaire à l'EndoIII bactérien. Par des approches de spectroscopie vibrationnelle, de spectroélectrochimie et des expériences de diffusion des rayons X aux petits angles (SAXS), nous avons révélé que ces deux formes d'enzyme possèdent des propriétés distinctes, et que le domaine N-terminal est important pour la liaison à l'ADN au début de la reconnaissance des dommages.

Moe E, Silveira CM, Zuccarello L, Rollo F, Stelter M, De Bonis S, Kulka-Peschke C, Katz S, Hildebrandt P, Zebger I, Timmins J & Todorovic S. Human Endonuclease III/NTH1 : Focusing on the [4Fe-4S] cluster and the N-terminal domain. Chem Comm (2022) 58 p. 12568-12571. DOI : 10.1039/D2CC03643F.

Reconstitution in vitro de la voie de réparation de l'ADN par excision de nucléotides de D. radiodurans

VAUCLARE Pierre — 2022-11-30T09:33:07Z

La réparation de l'ADN par excision de nucléotides (NER) est une voie de réparation de l'ADN capable d'éliminer des lésions très diverses de l'ADN, telles que les photoproduits de pyrimidine-pyrimidone (6-4) (6-4-PP), les dimères de cyclobutane-pyrimidine (CPD) et un large éventail de lésions créant des distorsions de la double hélice de l'ADN, dont les adduits. Chez les bactéries, cette voie est assurée par les protéines UvrA, UvrB et UvrC qui agissent séquentiellement pour libérer un oligonucléotide contenant la base endommagée. Dans ce travail, nous avons réussi à reconstituer un système NER bactérien efficace en utilisant un oligonucléotide original doublement marqué et des protéines UvrABC purifiées provenant de la bactérie radio-résistante, Deinococcus radiodurans.

Par rapport aux systèmes NER déjà existant, deux changements importants ont en effet été mis en œuvre. Premièrement, nous avons utilisé un oligonucléotide contenant une thymine conjuguée à la fluorescéine en position centrale, un substrat bien établi du NER, mais aussi un fluorophore rouge supplémentaire à l'extrémité 5' du brin contenant la lésion. Ces deux marquages nous ont permis de suivre les différents produits résultant de l'incision par les protéines Uvr. Deuxièmement, les protéines ont toutes été purifiées à partir d'un seul organisme, D. radiodurans, une bactérie mésophile. Grâce à ces protéines très stables, nous avons pu suivre le test sur des durées plus longues et travailler sur chaque composant de notre système. Ces deux caractéristiques nous ont permis de tester de nombreuses conditions afin d'optimiser le test d'incision in vitro pour obtenir une incision complète du substrat.

Ce test d'incision nouvellement développé sera sans aucun doute un outil utile pour des études ultérieures de la voie NER bactérienne. Le fait qu'il ait été entièrement optimisé va maintenant nous permettre de disséquer la contribution de chaque composant à la réaction de réparation. En nous appuyant sur ce travail, nous espérons ainsi prochainement faire la lumière sur certains des mécanismes complexes qui sous-tendent la NER.

Seck A, De Bonis S, Saint-Pierre C, Gasparutto D, Ravanat JL & Timmins J. In vitro reconstitution of an efficient nucleotide excision repair system using mesophilic enzymes from Deinococcus radiodurans. Communications Biology (2022). 5, 127. DOI : 10.1038/s42003-022-03064-x.

DdrC – une nouvelle protéine associée au nucléoïde (NAP) induite par les dommages à l'ADN

VAUCLARE Pierre — 2022-11-30T09:33:02Z

Deinococcus radiodurans présente un nucléoïde très compact, qui limite la dispersion des fragments d'ADN, facilitant ainsi les processus de réparation de l'ADN. Il est intéressant de noter qu'après une exposition aux rayonnements ionisants ou UV, la morphologie des nucléoïdes de D. radiodurans change rapidement pour adopter une conformation " super " compacte (données non publiées) et les diverses formes et structures observées dans les cellules en croissance exponentielle dans des conditions de croissance normales ne sont plus présentes (Floc'h et al, 2019). Le remodelage des nucléoïdes, et en particulier la compaction des nucléoïdes, a été observé chez de nombreuses bactéries, y compris chez des pathogènes humains ; il s'agit de l'une des stratégies d'adaptation les plus rapides et les plus efficaces, notamment en réponse à un stress soudain, et elle est souvent accompagnée de changements majeurs dans l'expression des gènes. Des études transcriptomiques sur D. radiodurans ont révélé que l'exposition aux rayonnements ionisants entraîne l'activation de nombreux gènes, y compris les gènes Ddr (DNA Damage Response) A, B, C et D, un ensemble de gènes spécifiques de Deinococcus codant pour des protéines de liaison à l'ADN qui pourraient potentiellement être impliquées dans la compaction des nucléoïdes induite par le stress.

Dans ce travail, nous avons utilisé une approche biologie structurale intégrative, combinant la cristallographie des protéines avec des essais biochimiques et biophysiques, la microscopie à force atomique et des simulations de dynamique moléculaire, pour déchiffrer la structure et la fonction de la protéine DdrC. Nous avons notamment déterminé sa structure cristalline et révélé qu'elle se replie sous la forme d'un dimère inhabituel, asymétrique, à domaine permuté. L'asymétrie de cet homo-dimère est remarquable car elle fournit deux surfaces distinctes de liaison à l'ADN, ce qui permet à DdrC d'interagir avec deux duplex d'ADN et de maintenir l'ADN circulaire dans une conformation plus contrainte, avec un surenroulement négatif. DdrC agit donc comme un ruban adhésif double face ! Ces résultats nous ont amenés à proposer que DdrC pourrait être une NAP induite par les dommages à l'ADN qui est rapidement recrutée dans le nucléoïde après irradiation, où elle peut contribuer à la compaction de l'ADN et limiter la dispersion des extrémités de l'ADN résultant des cassures double brin.

Banneville AS, Bouthier de la Tour C, De Bonis S, Hognon C, Colletier JP, Teulon JM, Le Roy A, Pellequer JL, Monari A, Dehez F, Confalonieri F, Servant P & Timmins J. Structural and functional characterization of DdrC, a novel DNA damage-induced nucleoid associated protein involved in DNA compaction. Nucleic Acids Research (2022) 50 (13) p. 7680-7696. DOI : 10.1093/nar/gkac563