IBS - Institut de Biologie Structurale - Grenoble / France

Méthodes : rationalisation de la cristallisation des protéines

ENGILBERGE Sylvain — 2022-10-18T17:14:49Z

Contact : Monika Spano

Une façon rationnelle de trouver les conditions appropriées pour faire croître des échantillons de cristaux exploitables pour la bio-cristallographie est d'explorer le diagramme de phase de cristallisation permettant le contrôle précis des paramètres affectant le processus de croissance cristalline. Tout d'abord, la nucléation est induite dans des conditions sursaturées proches de la limite de solubilité entre les régions de nucléation et métastable. Ensuite, la croissance du cristal est obtenue dans la zone métastable - qui est l'endroit optimal pour une expansion plus lente et ordonnée du cristal - par la modulation de paramètres physiques spécifiques. Une connaissance approfondie du diagramme de phase est vitale dans toute expérience de cristallisation. La pertinence de la sélection de la position de départ et de la voie cinétique entreprise pour contrôler la plupart des propriétés finales des cristaux synthétisés a été démontrée.
Les plateformes OptiCrys/MicroCrys permettent aux utilisateurs de bénéficier de stratégies rationnelles établies pour l'optimisation de la croissance des cristaux en utilisant un contrôle précis in situ de la température et de la composition chimique de la solution de cristallisation par dialyse (et microdialyse). Des diagrammes de phase systématiques dans un espace multidimensionnel sont étudiés en utilisant des faibles quantités de matériel protéique dans l'approche sérielle proposée par les instruments développés et en rupture avec le paradigme actuel des expériences parallèles.
Les stratégies de cristallisation rationnelles établies peuvent être bénéfiques pour fournir des échantillons exploitables pour la cristallographie neutronique des protéines qui nécessite des monocristaux bien ordonnés de grand volume, ainsi que pour générer des populations homogènes de cristaux de protéines de taille uniforme nécessaires à l'utilisation d'autres techniques de diffraction avancées (cristallographie sérielle aux rayons X, microdiffraction électronique).

Publications marquantes :

1. Large crystal growth for neutron protein crystallography. Budayova-Spano M, Koruza K, Fisher Z (2020) Methods Enzymol. 634, 21-46.

2. Optimization of crystallization of biological macromolecules using dialysis combined with temperature control. Junius N, Vahdatahar E, Oksanen E, Ferrer J-L, Budayova-Spano M (2020) J. Appl. Crystallogr. 53, 686-698.

3. Mixing Salts and Poly(ethylene glycol) into Protein Solutions : The Effects of Diffusion across Semipermeable Membranes and of Convection. Apostolopoulou V, Junius N, Sear RP, M. Budayova-Spano (2020) Cryst. Growth Des. 20, 3927-3936.

4. Optimization of crystal growth for neutron macromolecular crystallography. E. Vahdatahar E, Junius N, Budayova-Spano M (2021) J. Vis. Exp. 169, e61685

5. Crystallization of proteins on chip by microdialysis for in situ X-ray diffraction studies. Jaho S, Junius N, Borel F, Sallaz-Damaz Y, Salmon J-B, Budayova-Spano M (2021) J. Vis. Exp. 170, e61660

Instrument : OptiCrys/MicroCrys

ENGILBERGE Sylvain — 2022-10-18T16:16:32Z

Contact : Monika Spano

Les plateformes de cristallisation OptiCrys/MicroCrys (contact : Monika Spano)
Le banc de cristallisation (OptiCrys) est un prototype d'appareil intégré pour l'optimisation rationnelle de la croissance des cristaux en cartographiant et en manipulant les diagrammes de phase température-précipitant-concentration. Il comprend un montage de dialyse en cellule à écoulement (volume typique >20 μL) pour échanger les conditions et contrôler la température pendant les expériences. Sur la base de cet instrument à l'échelle macro, un dispositif miniaturisé qui permet un contrôle précis des paramètres expérimentaux exploitant les avantages de la microfluidique tels que le contrôle des phénomènes de transport et le volume réduit d'échantillon nécessaire par expérience (volume typique <1 μL) est également disponible (MicroCrys). La nouveauté repose sur l'utilisation de la méthode de dialyse dans un dispositif microfluidique unique et polyvalent, conçu pour répondre aux exigences de la cristallisation des protéines sur puce et de la cristallographie sérielle aux rayons X in situ. La concentration du précipitant est contrôlée via les deux plateformes (OptiCrys/MicroCrys) pour la manipulation des fluides et une interface logicielle interactive conçue pour la préparation de la solution de cristallisation. Les sels, solvants, tampons et autres solutions peuvent être prémélangés et sont ensuite pompés dans le système (macro/micro)fluidique de manière entièrement automatisée. La température est contrôlée à l'intérieur des dispositifs (macro/micro)fluidiques via un prototype utilisant un chauffage externe par des modules Peltier et des éléments en cuivre. Par conséquent, la distribution homogène de la température ou les gradients de température sont obtenus. Les paramètres physico-chimiques tels que la température, la concentration des agents cristallisants et le pH peuvent être contrôlés en temps réel pendant la cristallisation, de sorte que l'état de la substance étudiée se déplace le long d'une trajectoire cinétique bien définie dans le diagramme de phase. La membrane de dialyse permet d'ajuster le transfert de masse à travers la membrane pendant le processus de cristallisation. Par conséquent, les gradients créés peuvent être contrôlés et affectent la taille et la qualité des cristaux générés.

Publications marquantes :

1. A crystallization apparatus for temperature-controlled flow-cell dialysis with real-time visualization. Junius N, Oksanen E, Terrien M, Berzin C, Ferrer J-L, Budayova-Spano M (2016) J. Applied Crystallogr. 49, 806-813.

2. A microfluidic device for both on-chip dialysis protein crystallization and in situ X-ray diffraction. Junius N, Jaho S, Sallaz-Damaz Y, Borel F, Salmon J-B, Budayova-Spano M (2020) Lab Chip 20, 296-310.

Plate-forme : FIP2

ENGILBERGE Sylvain — 2022-10-18T16:04:47Z

BM07-FIP2 : Une ligne de lumière dédiée à la cristallographie macromoléculaire

Contact : Eric Mathieu or Sylvain Engilberge

La ligne de cristallographie macromoléculaire BM30A-FIP a été en opération entre 1999 et 2018 et a servi les communautés nationale et internationale des bio-cristallographes. Construite pour faciliter la détermination des structures de novo, FIP a constamment été à l'avant-garde des développements technologiques en matière d'automatisation basés sur l'utilisation de la robotique, notamment pour la diffraction in situ. Dans le cadre de la mise à niveau de l'ESRF (projet EBS), la ligne de lumière a été transférée sur le port BM07. Sa réouverture et sa mise à disposition de la communauté des utilisateurs est effective depuis fin 2021. FIP porte désormais le nom de BM07-FIP2.

Publications marquantes :

1. WIFIP : a web-based user interface for automated synchrotron beamlines. Sallaz-Damaz Y, Ferrer J-L (2017) J. Synchrotron Radiat. 24, 1105-1111

2. Combining 'dry' co-crystallization and in situ diffraction to facilitate ligand screening by X-ray crystallography. Gelin M, Delfosse V, Allemand F, Hoh F, Sallaz-Damaz Y, Pirocchi M, Bourguet W, Ferrer J-L, Labesse G, Guichou JF (2015) Acta Crystallogr. D71, 1777-1787.

3. A geometrical approach for semi-automated crystal centering and in situ X-ray diffraction data collection. Heidari Khajepour MY, Lebrette H, Vernede X, Rogues P, Ferrer J-L (2013) J. Appl. Crystallogr. 46, 740-745

Plate-forme : icOS

ENGILBERGE Sylvain — 2022-10-18T16:02:22Z

Le laboratoire de spectroscopie optique in crystallo icOS

Contact : Antoine Royant

Le laboratoire icOS Lab (appelé auparavant Cryobench) est une installation dédiée à la réalisation de diverses expériences de spectroscopie optique sur des cristaux de protéine dans des conditions (minidiffractomètre avec caméra de visualisation dans l'axe, changeur d'échantillon, température cryogénique ou ambiante) similaires à celles utilisées lors des collectes de données sur les lignes de cristallographie macromoléculaire de l'ESRF. Les spectroscopies disponibles sont l'absorption de lumière UV-visible, l'émission de fluorescence et le Raman. Des lasers et LED peuvent être utilisées comme sources de lumière actinique pour induire des changements photochimiques dans les échantillons. Ceux-ci sont habituellement des cristaux, mais on peut également étudier des nanolitres des solution. Le laboratoire icOS est souvent utilisé comme installation 'off-line' (c'est-à-dire que les expériences ne sont pas réalisées en même temps que l'expérience de diffraction correspondante). Il existe également un mode 'on-line' qui permet l'enregistrement entrelacé de données spectroscopiques et cristallographiques en utilisant soit un microspectrophotomètre d'absorption UV-visible (le 'on-line microspec') ou Raman (le 'Raman on-line'). Le laboratoire icOS procure ainsi des informations complémentaires qui peuvent être cruciales à l'interprétation correcte de structures cristallines. Les applications de ces techniques incluent l'identification de l'état physiologique de la protéine (par exemple l'état d'oxydation de centres métalliques), le suivi du dégât d'irradiation et la caractérisation d'intermédiaires réactionnels dans des expériences de cristallographie cinétique.

Publications marquantes :

1. Online Raman spectroscopy for structural biology on beamline ID29 of the ESRF. von Stetten D, Giraud, T, Bui S, Steiner RA, Fihman F, de Sanctis D, Royant A. (2017) J. Struct. Biol. 200, 124-127

2. In crystallo optical spectroscopy (icOS) as a complementary tool on the macromolecular crystallography beamlines of the ESRF. von Stetten D, Giraud T, Carpentier P, Sever F, Terrien M, Dobias F, Juers D H, Flot D, Mueller-Dieckmann C, Leonard G A, de Sanctis D, Royant A (2015) Acta Crystallogr. D71, 15-26