IBS - Institut de Biologie Structurale - Grenoble / France

Virulence et anticorps monoclonaux

JOB Viviana — 2026-01-26T10:07:47Z

Collaboration : Pascal Poignard, CAID group

La résistance aux antibiotiques constitue l'une des principaux problèmes de santé publique. Parmi les agents pathogènes multirésistants (MDR), le groupe ESKAPE de bactéries infectieuses (Enterococcus faecium, Staphylococcus aureus, Klebsiella pneumoniae, Acinetobacter baumannii, Pseudomonas aeruginosa et Enterobacter spp.) relève une importance particulière, car ces bactéries sont capables d'échapper aux thérapies antibiotiques les plus couramment utilisées.

Les anticorps monoclonaux (mAbs) ciblant des facteurs de virulence bactérienne offrent des perspectives alternatives très prometteuses aux antibiotiques, en raison de leur grande spécificité, de l'absence de résistances croisées et de la possibilité de synergie avec les antibiotiques. Ils pourraient également contribuer à réduire la propagation de la résistance aux antibiotiques grâce à une diminution du recours à ces derniers.

Dans le cadre du projet financé par l'ANR (HumaBact), nous exploitons les réponses humorales de patients atteints de mucoviscidose face à l'infection, en combinaison avec des criblages fonctionnels et des approches structurelles rationnelles, afin d'isoler des mAbs humains thérapeutiques ciblant des facteurs de virulence sélectionnés.

Figure 1 : Deux approches pour l'isolement d'anticorps monoclonaux humains à partir de patients infectés

En utilisant des plateformes établies d'isolement des anticorps (Figure 1), nous avons validé la protéine de la pointe du système de sécrétion de type III (T3SS), PcrV, comme première cible de virulence pour une stratégie de blocage de la virulence basée sur des anticorps monoclonaux [1].

Figure 2 : Évaluation de l'inhibition de la virulence du T3SS par des anticorps monoclonaux humains issus de patients atteints de mucoviscidose

Figure 3 : Différents mécanismes d'inhibition de l'injection des effecteurs par des anticorps monoclonaux anti-PcrV

(All figures are created in https://BioRender.com)

[1] https://elifesciences.org/reviewed-preprints/105195v1

ExoU trafficking

JOB Viviana — 2026-01-26T10:07:45Z

Collaboration : Yohan Couté, Edyp

Les toxines bactériennes ciblent des fonctions cellulaires clés afin de favoriser l'infection. Parmi les toxines bactériennes les plus puissantes figurent les phospholipases, qui endommagent la membrane plasmique et entraînent une nécrose ainsi que des lésions tissulaires. P. aeruginosa produit ExoU, une phospholipase exportée et injectée dans le cytoplasme de la cellule hôte par le système de sécrétion de type III (T3SS), aussi appelé injectisome. Nous avons précédemment réalisé deux découvertes majeures : l'une concernant la structure d'ExoU en complexe avec sa chaperonne SpcU [1] (Figure 1), et l'autre portant sur son trafic intracellulaire au sein de vésicules positives contenant DNAJC5 [2] (Figure 2).

Figure 1 : The crystal structure of ExoU in complex with its chaperone SpcU (adapted from Gendrin et al. 2012)

Plus récemment, nous avons utilisé des outils de marquage de proximité (proximity labeling, PL) ainsi que des approches cellulaires intégrées afin de mieux comprendre comment ExoU détourne la machinerie de trafic de la cellule hôte. Nous avons fusionné et exprimé l'extrémité C-terminale d'ExoU avec la biotine ligase UltraID. La sécrétion, la cytotoxicité et la dépendance à DNAJC5 de la protéine de fusion ont été confirmées. En présence de biotine exogène, UltraID biotinyle les protéines situées à proximité immédiate d'ExoU. Les protéines capturées par affinité à la streptavidine ont été soumises à une digestion à la trypsine suivie d'une analyse par LC-MS/MS. L'analyse par spectrométrie de masse a révélé huit protéines humaines significativement enrichies dans la condition UltraID par rapport au contrôle, parmi lesquelles RAB27B, SNAP23 et SLC3A2, que nous avons priorisées en raison de leurs rôles connus dans diverses voies de trafic intracellulaire.

En utilisant des cellules invalidées (KO) pour chacune de ces cibles, nous avons mis en évidence l'existence d'un équilibre fin entre la toxicité d'ExoU et les mécanismes de défense de la cellule hôte.

Figure 2 : Injection de ExoU et trafic de la cellule hôte (created in https://BioRender.com)

[1] Gendrin et al. https://journals.plos.org/plospathogens/article?id=10.1371/journal.ppat.1002637

[2] (Deruelle et al. https://www.nature.com/articles/s41467-021-24337-9

Paroi cellulaire de Pseudomonas

JOB Viviana — 2026-01-26T10:07:42Z

Collaboration : Pauline Macheboeuf, PG group

Le peptidoglycane (PG) est le principal composant de la paroi cellulaire, une structure rigide permettant aux bactéries de résister à la pression osmotique. C'est pour cette raison, que les enzymes impliquées dans la biosynthèse du PG constituent depuis des décennies les meilleures cibles de la thérapie antibiotique.

Le complexe MreBCD fait partie de la machinerie de synthese dite élongasome ; et avec RodA et PBP2, il est essentiel au maintien de la forme bacillaire des bactéries [1]. La structure de MreC seule [2], comparée à celle du complexe MreC-PBP2 [3] ou avec MreC-MreD [4], a révélé de possibles rôles régulateurs de MreC et de MreD dans la synthèse du PG .

Afin d'approfondir la compréhension des liens entre l'élongation et la division bactériennes, nous avons mis en place un criblage génétique de létalité synthétique (synthetic lethality) en utilisant un mutant P. aeruginosa ayant une diminution de l'expression du gène mreD (appelé mreD^down) présentant une morphologie arrondie (Figure 2). Nous avons identifié un ensemble de carboxy- et d'endo-peptidases comme étant synthétiquement létales dans le mutant mreD^down, suggérant des interactions complexes avec les protéines centrales de l'élongasome (Figure 1). Ce projet vise à caractériser de nouveaux partenaires de l'élongasome par des validations CRISPRi, des approches fonctionnelles in vivo et un analyse morphologique par microscopie de fluorescence (Figure 2).

Figure 1 : Différences de morphologie entre P. aeruginosa de type sauvage et le mutant mreD^down. Panneau supérieur : bactéries visualisées en microscopie confocale après marquage de la membrane (barre d'échelle : 2 µm). Panneau inférieur : images de cryo-microscopie électronique de bactéries congelées puis sectionnées (barre d'échelle : 200 nm).

Figure 2 : Schéma des deux machineries de synthèse du peptidoglycane (l'élongasome et le divisome) ainsi que du recyclage du PG. Certaines des protéines identifiées lors du criblage de létalité synthétique dans le mutant mreD^down sont indiquées en couleur (en vert si la mutation est bénéfique dans le mutant, en orange/jaune si la délétion de la protéine est délétère dans le mutant mreD^down).

[1] Liu X et al., https://journals.plos.org/plosgenetics/article?id=10.1371/journal.pgen.1009276

[2] Martins A et al., https://www.nature.com/articles/s41467-021-22957-9

[3] Contreras-Martel C et al., https://www.nature.com/articles/s41467-017-00783-2

[4] Morgan GS Gilman et al., https://www.biorxiv.org/content/10.1101/2024.10.08.617240v1

Présentation

JOB Viviana — 2022-11-15T14:42:59Z

Sommaire

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MOTS-CLES

Pseudomonas aeruginosa,Francisella tularensis, Klebsiella pneumoniae, résistance aux antibiotic , toxines, interaction hôte - pathogène, régulation, signalisation, infection nosocomiale, anti-virulence

SUJETS DE RECHERCHE

Les facteurs de virulence de P. aeruginosa
* Système de sécrétion de Type III – structure, fonction et inhibition
* Mécanismes d'action de la toxine ExoU – trafic intracellulaire
Résistance bactérienne vis-à-vis du système immunitaire – mécanismes de persistance (Pseudomonas et Klebsiella)
L'enveloppe de P. aeruginosa
* Etude de l'élongasome / divisome
* Etude du complexe Bam
Mécanismes de virulence de Francisella tularensis
* Mécanismes d'échappement au système immunitaire inné
* Facteur de virulence : système de sécrétion de Type VI
Anticorps monoclonaux (mAb) ciblant les facteurs de virulence bactériens

TECHNIQUES SPECIFIQUES

Génétique bactérienne (production de mutants KO)
Bactériologie cellulaire
Cribles à l'échelle génomique (CRISPR-Cas9, CRISPRi et Transposons)
NGS (Tn-Seq, WGS, DAP-Seq, CHIP-Seq, RNA-Seq...)
Microscopie (Microscopie à fluorescence, IF, 3D vidéo, microscopie confocale spinning-disk, microscopie automatisée et analyse d'images (MicrobeJ))
Interaction hôte - pathogène (modèles d'infection ex : Galleria mellonella, macrophages, cellules épithéliales et sang humain)
Compétitions bactériennes (E. coli, Pseudomonas sp, Acinetobacter, Bacillus sp…)
FACS (mesure des cytokines, détection et quantification des protéines de surface, test d'injection des toxines du T3SS en utilisant system rapporteur beta-lactamase, tri de cellules et de bactéries)
Expression et purification de protéines (chez E. coli, P. aeruginosa et en cellules eucaryotes)
Protéine-protéine et protéine-lipides interactions, purification de radeaux lipidiques

COLLABORATIONS

Harvard Medical School, Boston, US (Steve Lory)
Department of Medical Microbiology, Ultrecht, NE (Susan H.M. Rooijakkers)
Institut Pasteur, Paris (Carmen Buchrieser)
Equipe I2BA '"Inflammation, infections bactériennes et auto-inflammation", CIRI, Lyon (Thomas Henry)
Département de Pharmacochimie Moléculaire, Grenoble (Yung-Sing Wong)
Nano-Optics and Forces Team, Institut Néel, Grenoble (Jochen Fick)
IAB, Grenoble (A. Palencia)
CHU Avicenne, Bobigny (B. Lamy)
LGP2, Grenoble (N. Reverdy-Bruas, A. Denneulin)
Cermav, Grenoble (Sami Halila)
TrEE Team, TIMC LAB, Grenoble (Audrey Le Gouellec)
CEA/IRIG/Symmes, Grenoble (Thierry Livache)
CEA-LETI, Grenoble (P. Marcoux)
Équipe « Gen&Chem », Grenoble (Marie-Odile Fauvarque)
EDyP-Service, Grenoble (Yohann Couté)
IBS, Grenoble (Andrea Dessen et Pascal Poignard)