IBS - Institut de Biologie Structurale - Grenoble / France

Les secrets de la division de D. radiodurans

VAUCLARE Pierre — 2025-09-08T12:57:53Z

La septation de D. radiodurans observée par imagerie de fluorescence 3D et cryo-tomographie électronique sur lamelles de cellules

Contrairement à la plupart des bactéries, Deinococcus radiodurans se divise selon un mécanisme dit de « portes coulissantes ». Au lieu que la paroi cellulaire se referme comme un iris tout autour de la périphérie de la cellule, deux nouvelles parois cellulaires à bords plats se développent vers l'intérieur à partir des côtés opposés de la cellule, se rencontrant et fusionnant au milieu de la cellule. Afin d'élucider les mécanismes moléculaires sous-jacents à ce processus de division inhabituel, nous avons collaboré avec les groupes MICA et PG de l'IBS et combiné des approches d'imagerie de pointe. La microscopie de fluorescence sur cellules vivantes réalisée sur la plateforme d'imagerie M4D nous a permis d'observer la division des cellules en temps réel, tandis que la cryo-tomographie électronique réalisée sur de fines lamelles congelées de la bactérie a révélé divers intermédiaires de la division cellulaire et la fine architecture de la paroi cellulaire à chaque étape du processus. Cette puissante combinaison a permis de découvrir la structure complexe en couches de l'enveloppe de la bactérie et de montrer comment les septa ou « portes coulissantes » se développent, se redressent et fusionnent.

Une découverte frappante a été la présence de fines protubérances membranaires à l'extrémité des septa en croissance. Une autre découverte importante a été la présence d'une structure à double arche à l'extrémité des septa comportant une couche épaisse et rigide de peptidoglycane, correspondant à FtsZ et FtsA, deux acteurs clés de la division cellulaire bactérienne. Ces résultats suggèrent que la paire FtsA/FtsZ joue un rôle important dans la rigidification des septa en régulant l'emplacement du mécanisme de synthèse du peptidoglycane avec lequel elle interagit.

Publications

Gaifas L, Kleman JP, Lacroix F, Schexnaydre E, Trouvé J, Morlot C, Sandblad L, Gutsche I & Timmins J. Combining live cell fluorescence imaging with in situ cryo-electron tomography sheds light on the septation process in Deinococcus radiodurans. Proc. Nat. Acad. Sciences (2025) DOI : 10.1073/pnas.2425047122

Remodelage du nucleoïde et variation de la dynamique de la proteine HU chez Deinococcus radiodurans en réponse au stress

VAUCLARE Pierre — 2024-09-02T11:54:56Z

La réorganisation du nucléoïde est une stratégie commune de réponse au stress chez les bactéries afin de protéger leur patrimoine génétique. Ce processus est régulé par de petites protéines, les NAPs (Nucleoid-Associated Proteins), qui interagissent avec l'ADN et jouent un rôle clé dans l'organisation et la régulation du génome bactérien.
Par des approches de microscopie avancée conventionnelle et de super-résolution, nous avons récemment montré que l'exposition aux rayons UV-C ou l'entrée en phase stationnaire induit de profonds changements morphologiques et de volume du nucléoïde de Deinococcus radiodurans, ainsi que des modifications de la mobilité de la protéine HU, principale NAP de cette bactérie. Bien que ces deux stress provoquent une rapide compaction du nucléoïde, la diffusion de HU diminue en phase stationnaire alors qu'elle augmente suite aux UV-C, suggérant des mécanismes sous-jacents distincts.
De plus, nous avons montré que l'exposition aux UV-C entraine une réorganisation des nucléoïdes en trois étapes : une condensation rapide avec une augmentation de la diffusion de HU (sans doute induite par le relargage de HU de l'ADN génomique), suivie d'une décompaction plus lente pour restaurer la morphologie normale du nucléoïde accompagnée d'un retour à la normale de la mobilité de HU (associé au réassemblage de HU sur l'ADN génomique), avant enfin la reprise de la croissance et de la division cellulaire. Ces observations illustrent la diversité et complexité des processus de remodelage des nucléoïdes et représentent une première étape vers la compréhension des mécanismes impliqués et notamment du rôle clé de HU dans ce processus.

Réparation des lésions de l'ADN UV-induites par UvrC

HANS Fabienne — 2023-03-29T09:35:17Z

La réparation par excision de nucléotides (NER) est une voie de réparation de l'ADN conservée et présente dans tous les domaines de la vie. Elle est responsable de l'élimination d'une grande diversité de lésions de l'ADN dans le génome, telles que les dimères de pyrimidine induits par les rayons UV, mais aussi les adduits volumineux causés par le tabagisme ou les agents chimiothérapeutiques. Chez les bactéries, la NER est initiée par les protéines UvrA et UvrB qui, ensemble, localisent la lésion avant de recruter un troisième facteur, l'endonucléase, UvrC, qui coupe l'ADN de part et d'autre du site endommagé pour libérer un court fragment d'ADN contenant la lésion. Cette voie fait l'objet d'études depuis plus de 40 ans, et malgré cela, les mécanismes impliqués dans le recrutement et l'activation de la double activité d'incision d'UvrC ne sont encore que peu compris.
Dans la présente étude, nous avons utilisé des approches biochimiques et biophysiques, dont un test d'activité de réparation de l'ADN récemment mis au point dans notre équipe et reposant sur les protéines UvrA, UvrB et UvrC de Deinococcus radiodurans (Seck et al, Communications Biology, 2022), pour comparer les fonctions de liaison à l'ADN et à UvrB et l'activité d'incision de l'ADN, de formes sauvage et mutantes d'UvrC. Nous avons également construit le premier modèle 3D complet d'une protéine UvrC, assemblé à partir de la structure cristallographique de la région C-terminale d'UvrC et d'un modèle AlphaFold de la région N-terminale. L'ensemble de ces travaux révèle des caractéristiques inattendues des protéines UvrC et fournit des informations importantes sur le mécanisme d'activation d'UvrC au cours de la NER. En particulier, nous avons montré (i) qu'en l'absence de tout partenaire, UvrC réside dans un état inactif, qui ne peut pas effectuer de réactions d'incision indésirables qui seraient hautement préjudiciables à l'intégrité du génome, et (ii) l'activation d'UvrC nécessite un réarrangement conformationnel majeur, qui est probablement déclenché par son interaction avec le complexe UvrB-ADN de pré-incision de l'ADN. De plus, nous avons mis en évidence que la protéine UvrC de D. radiodurans possède plusieurs caractéristiques particulières qui en font une enzyme particulièrement robuste capable de rester active dans des conditions de stress induisant de forts dommages à l'ADN.

Seck A*, De Bonis S*, Stelter M, Ökvist M, Senarisoy M, Hayek MR, Le Roy A, Martin L, Saint-Pierre C, Silveira CM, Gasparutto D, Todorovic S, Ravanat JL & Timmins J. Structural and functional insights into the activation of the dual incision activity of UvrC, a key player in bacterial NER. (2023) Nucleic Acids Research. DOI : 10.1093/nar/gkad108. * Joint first authors.

Aperçu des fonctions du domaine N-terminal flexible et du cluster [4Fe-4S] de la NTH1 humaine

VAUCLARE Pierre — 2022-11-30T09:33:10Z

L'endonucléase III humaine ou hNTH1 est une enzyme contenant un groupe FeS, qui reconnaît et élimine les pyrimidines oxydées de l'ADN. Contrairement à ses homologues bactériens, hNTH1 possède une extension N-terminale de 100 acides aminés impliquée dans son adressage vers le noyau et la mitochondrie et dans la régulation de son activité catalytique par des interactions protéine-protéine. La structure cristalline d'une construction de hNTH1 tronquée en N-terminale a récemment été déterminée, confirmant la flexibilité intrinsèque de l'extension N-terminale et révélant une nouvelle conformation " ouverte " pour la région catalytique.

Dans ce travail, nous avons réalisé une étude biophysique comparative de la hNTH1 complète et d'une hNTH1 tronquée au niveau de l'extrémité N-terminale contenant uniquement le domaine catalytique, similaire à l'EndoIII bactérien. Par des approches de spectroscopie vibrationnelle, de spectroélectrochimie et des expériences de diffusion des rayons X aux petits angles (SAXS), nous avons révélé que ces deux formes d'enzyme possèdent des propriétés distinctes, et que le domaine N-terminal est important pour la liaison à l'ADN au début de la reconnaissance des dommages.

Moe E, Silveira CM, Zuccarello L, Rollo F, Stelter M, De Bonis S, Kulka-Peschke C, Katz S, Hildebrandt P, Zebger I, Timmins J & Todorovic S. Human Endonuclease III/NTH1 : Focusing on the [4Fe-4S] cluster and the N-terminal domain. Chem Comm (2022) 58 p. 12568-12571. DOI : 10.1039/D2CC03643F.

Reconstitution in vitro de la voie de réparation de l'ADN par excision de nucléotides de D. radiodurans

VAUCLARE Pierre — 2022-11-30T09:33:07Z

La réparation de l'ADN par excision de nucléotides (NER) est une voie de réparation de l'ADN capable d'éliminer des lésions très diverses de l'ADN, telles que les photoproduits de pyrimidine-pyrimidone (6-4) (6-4-PP), les dimères de cyclobutane-pyrimidine (CPD) et un large éventail de lésions créant des distorsions de la double hélice de l'ADN, dont les adduits. Chez les bactéries, cette voie est assurée par les protéines UvrA, UvrB et UvrC qui agissent séquentiellement pour libérer un oligonucléotide contenant la base endommagée. Dans ce travail, nous avons réussi à reconstituer un système NER bactérien efficace en utilisant un oligonucléotide original doublement marqué et des protéines UvrABC purifiées provenant de la bactérie radio-résistante, Deinococcus radiodurans.

Par rapport aux systèmes NER déjà existant, deux changements importants ont en effet été mis en œuvre. Premièrement, nous avons utilisé un oligonucléotide contenant une thymine conjuguée à la fluorescéine en position centrale, un substrat bien établi du NER, mais aussi un fluorophore rouge supplémentaire à l'extrémité 5' du brin contenant la lésion. Ces deux marquages nous ont permis de suivre les différents produits résultant de l'incision par les protéines Uvr. Deuxièmement, les protéines ont toutes été purifiées à partir d'un seul organisme, D. radiodurans, une bactérie mésophile. Grâce à ces protéines très stables, nous avons pu suivre le test sur des durées plus longues et travailler sur chaque composant de notre système. Ces deux caractéristiques nous ont permis de tester de nombreuses conditions afin d'optimiser le test d'incision in vitro pour obtenir une incision complète du substrat.

Ce test d'incision nouvellement développé sera sans aucun doute un outil utile pour des études ultérieures de la voie NER bactérienne. Le fait qu'il ait été entièrement optimisé va maintenant nous permettre de disséquer la contribution de chaque composant à la réaction de réparation. En nous appuyant sur ce travail, nous espérons ainsi prochainement faire la lumière sur certains des mécanismes complexes qui sous-tendent la NER.

Seck A, De Bonis S, Saint-Pierre C, Gasparutto D, Ravanat JL & Timmins J. In vitro reconstitution of an efficient nucleotide excision repair system using mesophilic enzymes from Deinococcus radiodurans. Communications Biology (2022). 5, 127. DOI : 10.1038/s42003-022-03064-x.

DdrC – une nouvelle protéine associée au nucléoïde (NAP) induite par les dommages à l'ADN

VAUCLARE Pierre — 2022-11-30T09:33:02Z

Deinococcus radiodurans présente un nucléoïde très compact, qui limite la dispersion des fragments d'ADN, facilitant ainsi les processus de réparation de l'ADN. Il est intéressant de noter qu'après une exposition aux rayonnements ionisants ou UV, la morphologie des nucléoïdes de D. radiodurans change rapidement pour adopter une conformation " super " compacte (données non publiées) et les diverses formes et structures observées dans les cellules en croissance exponentielle dans des conditions de croissance normales ne sont plus présentes (Floc'h et al, 2019). Le remodelage des nucléoïdes, et en particulier la compaction des nucléoïdes, a été observé chez de nombreuses bactéries, y compris chez des pathogènes humains ; il s'agit de l'une des stratégies d'adaptation les plus rapides et les plus efficaces, notamment en réponse à un stress soudain, et elle est souvent accompagnée de changements majeurs dans l'expression des gènes. Des études transcriptomiques sur D. radiodurans ont révélé que l'exposition aux rayonnements ionisants entraîne l'activation de nombreux gènes, y compris les gènes Ddr (DNA Damage Response) A, B, C et D, un ensemble de gènes spécifiques de Deinococcus codant pour des protéines de liaison à l'ADN qui pourraient potentiellement être impliquées dans la compaction des nucléoïdes induite par le stress.

Dans ce travail, nous avons utilisé une approche biologie structurale intégrative, combinant la cristallographie des protéines avec des essais biochimiques et biophysiques, la microscopie à force atomique et des simulations de dynamique moléculaire, pour déchiffrer la structure et la fonction de la protéine DdrC. Nous avons notamment déterminé sa structure cristalline et révélé qu'elle se replie sous la forme d'un dimère inhabituel, asymétrique, à domaine permuté. L'asymétrie de cet homo-dimère est remarquable car elle fournit deux surfaces distinctes de liaison à l'ADN, ce qui permet à DdrC d'interagir avec deux duplex d'ADN et de maintenir l'ADN circulaire dans une conformation plus contrainte, avec un surenroulement négatif. DdrC agit donc comme un ruban adhésif double face ! Ces résultats nous ont amenés à proposer que DdrC pourrait être une NAP induite par les dommages à l'ADN qui est rapidement recrutée dans le nucléoïde après irradiation, où elle peut contribuer à la compaction de l'ADN et limiter la dispersion des extrémités de l'ADN résultant des cassures double brin.

Banneville AS, Bouthier de la Tour C, De Bonis S, Hognon C, Colletier JP, Teulon JM, Le Roy A, Pellequer JL, Monari A, Dehez F, Confalonieri F, Servant P & Timmins J. Structural and functional characterization of DdrC, a novel DNA damage-induced nucleoid associated protein involved in DNA compaction. Nucleic Acids Research (2022) 50 (13) p. 7680-7696. DOI : 10.1093/nar/gkac563

Un biosenseur basé sur le FRET pour identifier des inhibiteurs de l'interface hNTH1-YB1

VAUCLARE Pierre — 2022-11-30T09:19:30Z

Chez les mammifères, plusieurs voies de réparation de l'ADN sont responsables de l'élimination des lésions de l'ADN et assurent ainsi la stabilité génomique. La voie de réparation par excision de base (BER) est responsable de l'élimination des petites lésions de base résultant de la désamination, de l'oxydation ou de la méthylation ; son action est connue pour réduire les effets cytotoxiques de certains médicaments anticancéreux. Par conséquent, les protéines impliquées dans le BER sont de plus en plus considérées comme des cibles pour le traitement du cancer.
L'une d'entre elles, l'endonucléase III humaine ou hNTH1, une ADN glycosylase bifonctionnelle responsable de l'élimination des pyrimidines oxydées, est régulée par la protéine multifonctionnelle Y-box binding protein 1 (YB1). Il est intéressant de noter que YB1 est un marqueur métastatique établi : son expression élevée et sa localisation nucléaire sont corrélées à une forte agressivité tumorale, à la chimio-résistance et à un mauvais pronostic dans diverses tumeurs. Dans ce travail, nous avons utilisé les technologies FRET (Förster Resonance Energy Transfer) et AlphaLISA pour caractériser cette interaction et définir les régions minimales de hNTH1 et YB1 nécessaires à la formation du complexe. Cette étude nous a conduit à concevoir un biocapteur original et à faible coût, basé sur le FRET et codé génétiquement, pour cribler in vitro de façon rapide et à haut débit des chimiothèques à la recherche d'inhibiteurs potentiels du complexe hNTH1-YB1. Deux cribles pilotes ont été réalisés permettant la sélection de plusieurs composés prometteurs. Parmi ceux-ci, deux se lient à YB1 et resensibilisent partiellement les cellules de tumeurs mammaires résistantes à l'agent chimiothérapeutique, le cisplatine.
Ce travail confirme donc le potentiel de l'interface hNTH1-YB1 comme cible thérapeutique pour le développement de nouveaux médicaments pour le traitement de tumeurs chimio-résistantes.

Senarisoy M, Barette C, Lacroix F, De Bonis S, Stelter M, Hans F, Kleman JP, Fauvarque M-O and Timmins J. A FRET-based biosensor for targeting the hNTH1-YB1 interface as a potential anti-cancer drug target. ACS Chemical Biology (2020) 15, 4, 990-1003. DOI : 10.1021/ acschembio.9b01023.

Changements de la forme et la structure du nucléoïde en fonction du cycle cellulaire

VAUCLARE Pierre — 2022-11-30T09:02:22Z

Deinococcus radiodurans est bien connu pour sa résistance exceptionnelle aux rayonnements ionisants. Dans cette étude, nous avons découvert que D. radiodurans est également particulièrement bien adaptée à l'imagerie optique sur cellules vivantes. Elle est relativement grande et son cycle cellulaire complet dure environ deux heures. Elle n'est donc ni trop lente ni trop rapide pour saisir les changements qui se produisent au niveau de la cellule et du nucléoïde pendant la croissance et la division de la bactérie.

Avec cette étude, nous avons entrepris d'évaluer la forme et la dynamique de son nucléoïde en fonction de son cycle cellulaire. Nous avons rapidement réalisé que les nucléoïdes de D. radiodurans n'adoptent pas seulement une forme toroïdale, mais qu'ils suivent plutôt une chorégraphie bien définie dans laquelle les structures en anneaux ne sont qu'un acte de ce ballet. Partant d'une conformation très compacte juste après la division, les nucléoïdes s'étendent ensuite pour adopter une forme toroïdale qui s'ouvre progressivement en croissant lorsque le cycle suivant de division cellulaire est initié. À mesure que la croissance septale progresse, les nucléoïdes en forme de croissant s'étirent le long de l'axe le plus long de la cellule et s'alignent perpendiculairement au futur axe de division. À ce stade, les génomes répliqués sont entraînés dans les deux cellules filles avant la fermeture du septum et les nucléoïdes nouvellement formés sont prêts à recommencer un nouveau cycle. On sait beaucoup de choses sur la condensation et la ségrégation des chromosomes chez les eucaryotes, mais jusqu'à présent ces processus n'avaient jamais été visualisés chez les bactéries. Dans cette étude, nous avons clairement démontré que les nucléoïdes bactériens ne sont pas des structures simples et statiques, mais plutôt des structures très complexes qui sont étroitement couplées à la progression du cycle cellulaire.

Floc'h K, Lacroix F, Servant P, Wong YS, Kleman JP, Bourgeois D and Timmins J. Cell morphology and nucleoid dynamics in dividing D. radiodurans. Nat Commun. (2019) 10 (1). p.3815. DOI : 10.1038/s41467-019-11725-5