IBS - Institut de Biologie Structurale - Grenoble / France

Photo-Commutation Positive : Un Nouveau Mécanisme Induit par la Lumière (2025)

BRUTSCHER Bernhard — 2025-04-24T15:05:50Z

Les protéines fluorescentes photoconvertibles (PCFPs) comme mEos4b changent leur émission de fluorescence du vert au rouge sous illumination à 405 nm, ce qui en fait des marqueurs essentiels pour les techniques de super-résolution telles que la Microscopie de Localisation de Molécules Uniques (SMLM). Cependant, leurs propriétés photophysiques ne cessent de révéler de nouvelles surprises. En plus de la photoconversion, les PCFPs peuvent commuter de manière réversible entre des états fluorescents et non fluorescents. Sous sa forme rouge, mEos4b subit une "commutation négative" : elle s'éteint sous la lumière à 561 nm et se réactive sous la lumière à 405 nm en raison de l'isomérisation cis-trans du chromophore. Dans cette collaboration entre les groupes I2SR et RMN de l'IBS, et le laboratoire SyMMES de l'IRIG, nous avons identifié un nouveau mode de "commutation positive" : la lumière à 405 nm éteint mEos4b rouge, tandis que la lumière à 561 nm la rallume — l'inverse de la commutation négative. En utilisant la spectroscopie UV-vis, l'imagerie par fluorescence, la RMN et la RPE, nous avons découvert que cette commutation positive provient d'une hétérogénéité conformationnelle induite par la lumière. Le travail montre que la forme rouge de mEos4b existe sous deux états fluorescents, distincts par leurs réseaux de liaisons hydrogène autour du chromophore. Sous illumination à 405 nm, l'état moins fluorescent s'accumule, tandis que la lumière à 561 nm ou l'obscurité favorise l'état plus lumineux. Notamment, l'état moins fluorescent possède un pKa plus élevé, ce qui le rend presque non fluorescent et de longue durée de vie à pH physiologique ou acide. Cette commutation positive entraîne un phénomène de clignotement (blinking) en SMLM, soulignant comment de subtils modifications conformationnelles induites par la lumière, souvent indétectables par cristallographie, impactent profondément l'imagerie de molécules uniques.

Journal of the American Chemical Society. (2025), Doi : 10.1021/jacs.4c17311

EL222 mise en lumière : Comment un photorécepteur module l'expression génique (2025)

BRUTSCHER Bernhard — 2025-04-24T12:53:45Z

La protéine EL222 de la bactérie marine Erythrobacter litoralis régule l'expression génique en réponse à la lumière bleue. Cette régulation se fait par des modifications conformationnelles déclenchées par l'activation d'une petite molécule à l'intérieur de la protéine, appelée flavine mononucléotide (FMN). Afin de mieux comprendre le fonctionnement de cette protéine, nous avons étudié les changements chimiques et structuraux d'EL222 sous exposition à la lumière bleue en combinant la cristallographie aux rayons X, les spectroscopies RMN et optique et des simulations de dynamique moléculaire. Dans ce travail collaboratif impliquant le groupe de RMN de l'IBS et des chercheurs de l'Institut de biotechnologie de l'Académie des sciences en république tchèque, nous révélons qu'EL222 passe par deux états distincts activés par la lumière, chacun étant lié à des changements chimiques spécifiques du FMN. Bien qu'EL222 soit principalement monomérique dans l'obscurité, l'exposition à la lumière favorise la formation de dimères, ce qui accroît sa liaison à un ADN double brin. Fait surprenant, toutes les formes d'EL222 peuvent s'associer à l'ADN, mais le déplacement de l'équilibre vers des complexes stables nécessite une exposition à la lumière bleue. Cette étude propose un nouveau modèle d'activation, où les modifications chimiques induites par la lumière au niveau du FMN générèrent une conformation ouverte de la protéine qui facilite l'auto-association et la liaison à l'ADN. Elle ouvre également la voie à l'optimisation des outils optogénétiques basés sur EL222 en ajustant l'intensité lumineuse afin de régler plus précisément les niveaux d'expression des gènes.

Nucleic Acids Research, 2025, 53, doi : 10.1093/nar/gkaf215

Expériences de RMN solide MAS sur les parois cellulaires des corynébactéries (2024)

Simorre Jean-Pierre — 2024-07-31T07:44:55Z

Les parois cellulaires bactériennes sont des polymères réticulés d'une taille de l'ordre du gigadalton qui présentent une large gamme d'amplitudes de mouvement, avec des parties plutôt rigides et d'autres très flexibles. La RMN de spinning à angle magique est une méthode puissante pour obtenir des informations au niveau atomique sur les parois cellulaires intactes. Nous étudions ici la sensibilité et le contenu informatif de différentes expériences de corrélation homonucléaire 13C13C et hétéronucléaire 1H15N, 1H13C et 15N13C. Nous démontrons qu'une cryosonde CPMAS permet d'obtenir un rapport signal/bruit environ 8 fois supérieur à celui d'une sonde à température ambiante, soit une sensibilité par masse environ 3 à 4 fois supérieure. La sensibilité accrue a permis d'obtenir des spectres à haute résolution même sur des bactéries intactes. En outre, nous comparons la résolution et la sensibilité des expériences 1H MAS obtenues à 100 kHz par rapport à 55 kHz. Notre étude fournit des indications utiles pour choisir les expériences permettant d'extraire des détails au niveau atomique sur des échantillons de parois cellulaires.

Zoom sur l'environnement du chromophore d'une protéine fluorescente (2021)

BRUTSCHER Bernhard — 2024-07-30T13:57:22Z

Sommaire

Collaboration :

Les protéines fluorescentes de la famille des GFP qui changent d'état fluorescent lors de l'illumination à des longueurs d'onde spécifiques sont des marqueurs largement utilisés pour les modalités d'imagerie à super-résolution. Cependant, les propriétés photophysiques de ces protéines dépendent crucialement des conditions environnementales dans lesquelles elles sont exprimées et utilisées. Actuellement, les stratégies basées sur la conception rationnelle pour améliorer les protéines fluorescentes exploitent principalement les informations mécaniques disponibles à partir des structures cristallographiques aux rayons X, qui manquent d'informations importantes sur la dynamique conformationnelle, les états de protonation et les liaisons hydrogène, ainsi que leur dépendance aux conditions physico-chimiques.
Dans ce travail collaboratif impliquant les groupes RMN et I2SR, nous nous sommes concentrés sur rsFolder, une protéine fluorescente verte réversiblement commutable, conçue à l'IBS. Nous avons démontré que la spectroscopie RMN en solution peut détecter des changements subtils dans l'environnement du chromophore avec une résolution atomique, fournissant de nouvelles perspectives sur la dépendance au pH des propriétés de commutation photo-observées de rsFolder. Nos résultats peuvent être exploités pour concevoir et tester de nouvelles variantes de protéines fluorescentes avec une robustesse accrue face aux changements environnementaux. Ce travail introduit également la spectroscopie RMN dans le domaine de la recherche sur les protéines fluorescentes en tant que nouvel outil pour sonder les populations d'états du chromophore et la dynamique en fonction de diverses conditions environnementales.
Publication : Christou et al. J. Am. Chem. Soc. 2021, 143, 19, 7521–7530, doi : 10.1021/jacs.1c02442

Collaboration :

D. Bourgeois (IBS

L'hétérogénéité conformationnelle dans mEos4b affecte ses propriétés photophysiques (2023)

BRUTSCHER Bernhard — 2024-07-30T13:52:08Z

mEOS4b_Green_heterogeneity

Les protéines fluorescentes photoconvertibles (PCFP) telles que mEos4b changent de couleur de fluorescence, passant du vert au rouge, lorsqu'elles sont illuminées par de la lumière UV. Elles sont des marqueurs populaires pour les modalités d'imagerie à super-résolution telles que la microscopie de localisation de molécule unique quantitative et de suivi de particules individuelles (SMLM). Cependant, les propriétés photophysiques de ces protéines sont extrêmement complexes. Dans ce travail collaboratif impliquant les groupes RMN et I2SR de l'IBS, nous avons observé par spectroscopie RMN multidimensionnelle que mEos4b présente deux conformations distinctes dans l'état vert qui s'interconvertissent lentement. La RMN a également révélé que ces conformations diffèrent par les états de protonation de deux chaînes latérales d'acides aminés dans la poche du chromophore, ce qui modifie le réseau de liaisons hydrogène. Ces réarrangements subtils n'étaient pas visibles dans les structures aux rayons X à haute résolution de mEos4b.
Il est important de noter que seule l'une de ces conformations se photoconvertit efficacement à l'état rouge, tandis que l'autre semble être plus sujette au photoblanchiment. Cette étude aide à expliquer le comportement photophysique complexe observé de mEos4b et des PCFP similaires. Plus généralement, elle révèle comment la dynamique conformationnelle des protéines fluorescentes affecte leurs propriétés photophysiques, en particulier les mécanismes de photoconversion des PCFP dérivés de mEos. Enfin, nos résultats ouvrent la voie à la conception de nouvelles variantes de PCFP avec une efficacité de photoconversion supérieure.
Maity et al. Adv. Sci. 2023, 2306272, doi : 10.1002/advs.202306272
Collaboration : D. Bourgeois (IBS)

Interaction de MapZ avec FtsZ et les membranes chez Streptococcus pneumoniae (2020)

Simorre Jean-Pierre — 2024-07-30T08:56:10Z

MapZ se localise au milieu de la cellule et agit comme une balise moléculaire pour le positionnement de la machinerie de division cellulaire chez la bactérie Streptococcus pneumoniae. MapZ contient une seule hélice transmembranaire qui sépare le domaine extracellulaire C-terminal du domaine cytoplasmique N-terminal. Seules la structure et la fonction du domaine extracellulaire sont connues. Nous démontrons ici qu'une grande partie du domaine cytoplasmique est intrinsèquement désordonnée et qu'il existe deux régions (des résidus 45 à 68 et 79 à 95) qui ont tendance à se replier en hélices amphipathiques. Nous révélons également que ces régions interagissent avec la surface des liposomes qui imitent la membrane cellulaire de Streptococcus pneumoniae. La région N-terminale hautement conservée et dépliée (des résidus 17 à 43) interagit spécifiquement avec FtsZ indépendamment de l'état de polymérisation de FtsZ. De plus, nous montrons que la phosphorylation de MapZ aux positions Thr67 et Thr68 n'a pas d'impact sur l'interaction avec FtsZ ou les liposomes. Dans l'ensemble, nous proposons un modèle dans lequel le recrutement de FtsZ par MapZ au milieu de la cellule est modulé par la compétition de la liaison de MapZ à la membrane cellulaire. L'interaction moléculaire entre les composants de ce complexe tripartite pourrait représenter une étape clé vers l'assemblage complet du divisome.

Collaboration : C. Grangeasse (CNRS, Lyon)

Activateur de la synthase du peptidoglycane LpoP chez Pseudomonas aeruginosa (2020)

Simorre Jean-Pierre — 2024-07-30T08:45:15Z

Le peptidoglycane (PG) est un composant essentiel de la paroi cellulaire bactérienne et est assemblé à partir d'un précurseur lipidique II par des réactions de glycosyltransférase et de transpeptidase catalysées en particulier par des protéines de liaison à la pénicilline de classe A bifonctionnelles (aPBPs). Chez le principal pathogène clinique Pseudomonas aeruginosa, PBP1B est ancré dans la membrane cytoplasmique mais régulé par une lipoprotéine spécialisée localisée dans la membrane externe, connue sous le nom de LpoP. Ici, nous rapportons la structure de LpoP, montrant une attache flexible N-terminale étendue suivie d'un domaine bien ordonné de répétitions tandem tétratricopeptidiques C-terminales. Nous montrons que LpoP stimule les activités transpeptidase et glycosyltransférase de PBP1B in vitro et interagit directement via son domaine globulaire C-terminal avec le domaine central UB2H de PBP1B. Contrairement à la situation chez E. coli, CpoB de P. aeruginosa ne régule pas PBP1B/LpoP in vitro. Nous proposons un mécanisme qui aide à souligner les similitudes et les différences dans l'activation des PBP de classe A chez les bactéries à Gram négatif.

Collaboration : W. Vollmer (NewCastle Univ., UK), Natalie Strynadka (Vancouver, Canada)

Suivre les antibiotiques au sein de cellules bactériennes vivantes (2024)

Simorre Jean-Pierre — 2024-07-29T15:28:00Z

Suivre les antibiotiques au sein de cellules bactériennes vivantes

Cette étude a montré comment la résonance magnétique nucléaire se révèle être un outil analytique puissant pour mieux suivre le devenir des antibiotiques face aux phénomènes de résistance et potentiellement aider à les rendre plus efficaces.

La production d'enzymes appelées β-lactamases constitue un des principaux indicateurs cliniques de l'émergence de la résistance chez de nombreuses bactéries. Ces β-lactamases ont la capacité de dégrader les antibiotiques β-lactames* les rendant ainsi inactifs. Produites par la bactérie dans son périplasme, un compartiment délimité par ses membranes internes et externes, ces enzymes renforcent la défense de la bactérie contre l'intrusion des antibiotiques. Grâce au développement d'une méthode de suivi in situ par résonance magnétique nucléaire de l'activité enzymatique se déroulant dans la cellule, il a été possible d'analyser en temps réel la dégradation des β-lactames par les β-lactamases dans des souches résistantes. En utilisant des inhibiteurs spécifiques des enzymes β-lactamases, la capacité des β-lactames à franchir la membrane externe, à interagir avec leur cible et finalement à bloquer au moins partiellement la dégradation des antibiotiques a pu être évaluée Ces mesures permettent d'obtenir des informations sur la nature et la localisation de ces interactions entre les inhibiteurs et les enzymes, en les mesurant directement au sein de la cellule.

Cette étude, parue dans J. Am. Chem. Soc., montre que la RMN sur cellule vivante constitue un outil analytique puissant pour l'étude de nouvelles molécules ciblant spécifiquement les composants moléculaires du périplasme bactérien responsables de l'antibio-résistance. Cette approche va permettre d'évaluer l'efficacité des médicaments directement dans leur environnement, ouvrant pourquoi-pas la voie à une médecine personnalisée en proposant une antibiothérapie spécifique pour chaque patient en fonction du micro-organisme responsable de l'infection résistante.

Collaborations : M Arthur (INSERM, Paris), A. Dessen (IBS, Grenoble)

Présentation

FAVIER Adrien — 2022-11-16T08:29:41Z

Crédit : Alicia Vallet

Responsable : Bernhard Brutscher

Actuellement, le groupe est composé de deux équipes de recherche dirigées par JP. Simorre et B. Brutscher. Les deux équipes développent et exploitent des méthodologies modernes de RMN pour répondre à diverses questions biologiques et biophysiques. Les principaux sujets de recherche actuels se concentrent sur (i) la biogenèse de la paroi cellulaire bactérienne et le développement de nouvelles stratégies antibiotiques ; et (ii) la compréhension mécanistique des transformations induites par la lumière des protéines fluorescentes et autres protéines sensibles à la lumière. Ces sujets sont principalement abordés par des méthodes de RMN, complétées par d'autres techniques biophysiques et biochimiques, notamment SAXS, la microscopie électronique et optique, et la cristallographie aux rayons X, ainsi que par des expériences in vivo/fonctionnelles. Pour mener à bien ce travail, nous avons établi un réseau de collaborateurs de renommée internationale dans ces domaines. Le groupe mène également une activité intense dans le développement de méthodes innovantes de RMN, à la fois en solution et en état solide, et a fait des efforts significatifs pour rendre ces outils disponibles à la communauté scientifique.

Transitions conformationnelles de l'ARN et activité de protéines chaperones de l'ARN (2017)

FAVIER Adrien — 2022-11-10T16:43:15Z

Les protéines chaperonnes aident les ARN à adopter leurs états fonctionnels pertinents. On sait cependant peu de choses sur les détails mécanistiques de l'activité chaperonne de l'ARN. Nous avons utilisé une combinaison de méthodes de RMN en temps réel et en régime permanent pour déchiffrer les voies de formation du duplex d'ARN de deux épingles à cheveux d'ARN complémentaires, ainsi que l'activité chaperonne de la petite protéine bactérienne de choc froid CspA sur cette réaction de repliement.
Collaborations : C. Kreutz (Innsbruck, Autriche), R. Konrat (Vienne, Autriche)