IBS - Institut de Biologie Structurale - Grenoble / France

Nouveaux antibactériens

ZAPUN André — 2025-08-29T13:24:37Z

Responsables : Pauline Macheboeuf et Carlos Contreras-Martel

Sommaire

L'émergence de souches bactériennes pathogènes multirésistantes représente un défi majeur pour la médecine moderne. L'incidence des « superbactéries » — des micro-organismes résistants à la majorité des antibiotiques actuellement disponibles — augmente à un rythme alarmant. Aux États-Unis et en Europe, cinq agents pathogènes bactériens sont responsables de la majorité des infections nosocomiales. Regroupés sous l'acronyme « ESKAPE » — Enterococcus faecium, Staphylococcus aureus, Klebsiella pneumoniae, Acinetobacter baumannii, Pseudomonas aeruginosa et les espèces Enterobacter — ces organismes doivent leur nom à leur capacité croissante à « échapper » aux traitements antibiotiques existants.
Des données récentes indiquent que, dans plusieurs pays européens, plus de 70 % des isolats bactériens pathogènes présentent une résistance à au moins un antibiotique actuellement utilisé en clinique. De manière préoccupante, malgré la menace croissante que représente la résistance aux antimicrobiens pour la santé publique, la plupart des grandes entreprises pharmaceutiques ont considérablement réduit, voire complètement abandonné, leurs efforts dans la recherche de nouveaux antibiotiques. Par conséquent, il existe un besoin médical urgent de développer de nouveaux agents antibactériens capables de lutter contre ces bactéries résistantes.
La paroi bactérienne est principalement constituée de peptidoglycane (PG), un polymère tridimensionnel formé de sous-unités disaccharidiques reliées entre elles par des tiges pentapeptidiques. Ce réseau confère à la cellule bactérienne sa forme, lui permet de résister à la pression osmotique et joue un rôle essentiel dans la division cellulaire. En raison de son importance vitale et de son absence chez les eucaryotes, le PG constitue depuis plusieurs décennies une cible privilégiée pour le développement de nouveaux antibiotiques.
Notre recherche se concentre sur deux étapes distinctes de la biosynthèse du PG chez les bactéries à Gram négatif :
• La synthèse du précurseur cytoplasmique du PG, assurée par le complexe enzymatique des ligases Mur, ainsi que son recrutement dynamique par les machineries de synthèse de la paroi, aux différentes étapes du cycle cellulaire bactérien.
• Le développement de nouvelles molécules inhibitrices ciblant les penicillin-binding proteins (PBP), impliquées dans les étapes terminales de l'assemblage périplasmique du PG.

Synthèse du peptidoglycane

Les Mur ligases

Les protéines impliquées dans la biosynthèse du PG s'organisent en complexes multiprotéiques qui coordonnent les processus d'élongation et de division cellulaire. L'inhibition ou la dérégulation de ces protéines entraîne des altérations morphologiques, souvent suivies de lyse et de mort cellulaire. Parmi elles, les protéines cytoplasmiques de type Mur ont été proposées comme formant des complexes fonctionnels, une hypothèse appuyée par le fait que, chez de nombreuses bactéries, les gènes mur, organisés en opérons hautement conservés, ont fusionné pour coder des protéines chimériques.
Une analyse génomique menée sur plus de 140 génomes bactériens nous a permis de caractériser, en particulier, la chimère MurE-MurF de Bordetella pertussis, par cristallographie aux rayons X et polarisation de fluorescence. L'architecture allongée de cette chimère révèle une proximité des deux sites actifs, et nos données d'interaction suggèrent que MurE-MurF peut interagir avec d'autres ligases Mur via ses domaines centraux (Shirakawa et al., PNAS, 2023). Ces résultats mettent en évidence de fortes contraintes évolutives favorisant le maintien d'une proximité génomique entre les gènes, en particulier lorsque les protéines codées interagissent physiquement. Cela établit un lien entre l'assemblage des ligases Mur en complexes fonctionnels et l'évolution des génomes bactériens. En plus de révéler l'interface moléculaire entre les sous-unités MurE et MurF, cette étude ouvre la voie à l'élucidation de la structure complète du complexe de ligases Mur.
Par ailleurs, le complexe des ligases Mur doit être orienté vers l'élongasome ou le divisome, deux structures en compétition pour l'utilisation des précurseurs du PG à différents stades de la croissance bactérienne. Nous avons découvert que certains gènes mur sont fusionnés à des gènes de division cellulaire, conduisant à la production de protéines chimériques associant physiquement les complexes Mur et le divisome. Une meilleure compréhension de l'architecture et de la dynamique de ces complexes au sein de la cellule bactérienne ouvre la voie à l'identification de nouvelles cibles pour le développement d'agents antibactériens innovants.

MurE-MurF

Les penicillin-binding proteins (PBP)

Les PBP catalysent les dernières étapes de la biosynthèse du PG et constituent les cibles des antibiotiques de la famille des bêta-lactamines, tels que la pénicilline. Cependant, face au développement croissant de l'antibiorésistance, il devient essentiel de rechercher en permanence de nouvelles molécules capables d'inhiber efficacement les PBP. L'élaboration de ces inhibiteurs repose sur une approche structurale, fruit d'une collaboration étroite entre des chimistes et notre équipe. Ce travail comprend la synthèse chimique de nouvelles molécules, l'évaluation de leurs interactions avec les PBP, ainsi que l'analyse cristallographique des complexes formés. Ces données permettent de mieux comprendre les mécanismes d'interaction et d'améliorer la sélectivité des inhibiteurs candidats.
Dans nos travaux précédents, nous avons apporté une contribution majeure à ce domaine en publiant de nombreuses structures cristallographiques de protéines de liaison à la pénicilline (PBPs) en complexe avec divers ligands. Ces données structurales, obtenues en partie grâce à des collaborations fructueuses avec plusieurs groupes de chimie médicinale à travers le monde, ont largement soutenu le développement de nouvelles molécules inhibitrices. Nos recherches se sont principalement concentrées sur la PBP1b de Streptococcus pneumoniae, étudiée en interaction avec différents antibiotiques ainsi qu'avec des sondes biochimiques telles que des pseudo-substrats, des lactivicines, des boronates et des β-lactones. Les PBPs représentent des cibles thérapeutiques de choix pour plusieurs raisons fondamentales : (1) elles sont essentielles à la survie bactérienne ; (2) leur substrat naturel, le peptidoglycane, est spécifique aux bactéries ; et (3) elles ne possèdent pas d'homologue chez l'Homme, réduisant ainsi les risques d'effets secondaires hors cible. De plus, notre laboratoire a résolu de nombreuses structures cristallines de PBP, fournissant une base solide pour la modélisation in silico et la conception rationnelle de nouveaux inhibiteurs à visée thérapeutique.

PBPs du pneumocoque

Notre objectif actuel est donc de concevoir de nouveaux agents antimicrobiens en s'appuyant sur des données structurales expérimentales à haute résolution de complexes PBP–inhibiteurs. Ces complexes sont issus à la fois de pathogènes à Gram négatif du groupe ESKAPE, et de notre modèle à Gram positif, S. pneumoniae. Cette approche structure-guidée vise à identifier des inhibiteurs innovants, capables de contourner les mécanismes d'antibiorésistance, en ciblant spécifiquement les PBPs essentiels de ces bactéries.

Enveloppe de la spore bactérienne

ZAPUN André — 2024-06-19T14:21:32Z

Responsable : Cécile Morlot

Collaborations :

C. Rodrigues, Warwick University, UK
Benoit Gallet & Christine Moriscot (Team headed by G. Schoehn, IBS)

Les spores bactériennes sont des cellules dormantes qui peuvent résister à un large éventail de stress, notamment aux antibiotiques, aux détergents, à des irradiations et des températures élevées. Cette résistance est un atout lorsque les spores sont utilisées au profit de l'Homme (probiotiques, technologies d'administration à base de spores), mais elle représente un problème majeur en termes de maladies infectieuses, de sécurité alimentaire ou de guerre biologique lorsqu'il s'agit de spores de bactéries pathogènes (spores de Bacillus anthracis ou de Clostridium difficile).
Lors d'un stress environnemental, les bactéries sporulantes initient un processus de différenciation qui commence par une division asymétrique (stade I), donnant naissance à deux compartiments morphologiquement différents : une grande cellule mère et une petite préspore, dans laquelle une copie complète du chromosome est transférée (stade IIE). Ces deux cellules sont génétiquement identiques, mais elles vont suivre des programmes d'expression génétique spécifiques, régis par des facteurs sigma (σ) finement régulés.
Suite à la division asymétrique, la cellule mère et la préspore sont séparées par un espace intermembranaire (IMS) composé de deux membranes et de peptidoglycane (PG). Les deux cellules vont ensuite subir des changements morphologiques spectaculaires, la forespore étant progressivement internalisée au sein de la cellule mère par un processus phagocytaire appelé "engulfment" (stade IIM), qui nécessite une synthèse et une dégradation coordonnées de PG. La préspore phagocytée est entourée de sa propre membrane cytoplasmique et d'une seconde membrane dérivée de la cellule mère (stade III). La cohésion structurale de ces deux membranes est assurée par le complexe SpoIIIA-SpoIIQ (complexe A-Q), une nanomachine protéique qui traverse l'enveloppe de la préspore et qui est par ailleurs nécessaire au maintien de sa physiologie. Au cours de l'engulfment, des couches de protéines protectrices (appelées "coat") s'assemblent à la surface de la préspore. Un PG modifié, appelé le cortex, est ensuite synthétisé dans l'IMS. La spore mature est finalement libérée dans l'environnement par lyse de la cellule mère (stade VI). La spore peut rester dormante pendant des milliers d'années, tout en restant réceptive à son environnement, de sorte qu'elle puisse germer et reprendre sa croissance végétative en présence de conditions appropriées.

Illustration schématique des principaux changements ultrastructuraux au cours de la sporulation.

Malgré leur importance pour l'acquisition des propriétés de résistance, les mécanismes impliqués dans le développement des spores ne sont pas encore totalement élucidés, principalement parce qu'ils impliquent des complexes macromoléculaires de dimensions nanométriques, dont l'assemblage nécessite généralement l'environnement cellulaire.
Un premier exemple est le complexe multiprotéique transmembranaire A-Q (> 2 MDa). En son absence, la spore présente des défauts de forme et n'acquiert pas la capacité de résister à des environnements extrêmes. La structure et la fonction du complexe A-Q restent énigmatiques, mais ses similitudes structurales avec des systèmes de sécrétion spécialisés et des pompes à protons suggèrent qu'il pourrait s'agir d'un nouveau type de machinerie de transport, permettant à la cellule mère de "nourrir" la spore ou de transporter des molécules spécifiques entre les deux compartiments cellulaires (Morlot et Rodrigues, Trends Microbiol., 2018). Nous étudions ce complexe chez Bacillus subtilis pour élucider ses relations structurales et évolutives avec d'autres systèmes de transport, pour déterminer la nature de la molécule sécrétée et son rôle dans le développement des spores (Collab. C. Rodrigues, Warwick Univ.). Nous avons découvert que le composant A-Q appelé SpoIIIAG (AG) forme de grands anneaux homo-oligomériques dont l'architecture et les dimensions rappellent les composants annulaires des systèmes de sécrétion de type III (Rodrigues et al., PNAS, 2016). En outre, l'analyse structurale de diverses protéines associées au complexe A-Q a révélé des motifs structuraux nécessaires à la formations d'anneaux et ouvert des pistes de recherche sur des fonctions alternatives (https://www.sciencedirect.com/science/article/pii/S1047847718302703?via%3Dihub ; Liu et al., J. Struct. Biol., 2022).
Nous développons maintenant des approches de cryo-tomographie pour étudier la structure du complexe A-Q in cellulo.

A. Cellules de B. subtilis sporulantes exprimant une protéine localisée autour de la préspore et fusionnée à la GFP. Les membranes sont marquées avec un fluorophore (rouge). B. Modèle de l'assemblage du complexe A-Q à l'interface entre la cellule mère et la spore en développement. L'illustration montre l'anneau AG (cyan), des anneaux putatifs s'empilant dans l'espace intermembranaire et des pores membranaires hypothétiques (gris). C. Structure cristallographique d'une protéine de sporulation contenant un motif canonique de construction d'anneaux (vert) et des structures secondaires supplémentaires (orange).

Parmi les déterminants de la résistance des spores figure une carapace extracellulaire constituée de couches protéiques appelées manteau ou "coat". Son assemblage repose sur un réseau complexe d'interactions impliquant d'abord une dizaine de protéines morphogénétiques, puis plus de 80 protéines différentes. Malgré leur importance pour l'acquisition des propriétés de résistance, l'architecture des différentes couches du manteau reste mal comprise, car leur dépôt et leur maturation est un processus long (> 7 h) et complexe. En collaboration avec le groupe de Guy Schoehn à l'IBS, nous utilisons la cryo-tomographie électronique (cryo-ET) sur des lamelles de spores générées par cryo-FIBM/SEM (cryo-focused ion beam milling coupled to scanning electron microscopy) pour étudier la formation de l'enveloppe chez B. subtilis. Nous avons récemment montré qu'à des stades précoces de sporulation, le manteau est constitué d'un empilement de couches embryonnaires distinctes, dont l'architecture nécessite des protéines morphogénétiques spécifiques (Bauda et al., Nature Comm., 2024).
Ce travail fournit un socle de connaissances de départ pour la dissection des mécanismes moléculaires impliqués dans le développement et la résistance de la spore bactérienne. Notre prochain objectif est de développer le cryo-CLEM super-résolu (cryo-PALM couplé à la cryo-FIBM/SEM et à la cryo-tomographie) afin d'élucider la structure et la composition des couches de l'enveloppe tout au long du cycle de sporulation.

Tranche de tomograme (panneau de gauche) montrant l'ultrastructure d'une cellule sporulante de B. subtilis. Le tomograme a permis de segmenter (panneaux du milieu et de droite) divers composants de la préspore et de la cellule mère.

Enveloppe cellulaire du pneumocoque

ZAPUN André — 2024-06-18T11:39:17Z

Responsable : Cécile Morlot

Sommaire

Assemblage et architecture du peptidoglycane

Collaborations :

C. Grangeasse, MMSB, Lyon
YS. Wong, DPM, Grenoble
L. Pasquina-Lemonche, Sheffield University, UK
C. Moriscot & B. Gallet (Team headed by G. Schoehn), IBS, Grenoble

La croissance, la division et la survie des bactéries sont intimement liées à la synthèse et à la maturation de la paroi cellulaire. La paroi offre une résistance mécanique aux stress externes et internes (comme la pression de turgescence) et confère à la cellule une forme spécifique. Elle est également impliquée dans les interactions avec les organismes voisins (cellules procaryotes et eucaryotes), dans la reconnaissance des bactéries par le système immunitaire inné de l'hôte, et son assemblage est la cible de nombreux antibiotiques. La paroi cellulaire est donc un pilier central de la vie bactérienne.
Chez les bactéries à Gram positif, la paroi contient deux composants principaux, le peptidoglycane (PG, un maillage très résistant de chaînes de glycanes réticulées par de courts peptides) et les acides teichoïques (TA, des répétitions d'unités polysaccharidiques complexes). Cible éminente de nos antibiotiques les plus efficaces (β-lactames et glycopeptides), le PG a été largement étudié, mais les mécanismes par lesquels il atteint sa composition et son architecture finales restent obscurs.
Notre modèle principal pour l'étude de l'assemblage et de l'architecture du PG est le pathogène humain opportuniste Streptococcus pneumoniae (le pneumocoque). Le pneumocoque est une bactérie ovoïde Gram-positive commensale de la flore naso-pharyngée d'environ 10 % de la population humaine. Lorsqu'il envahit d'autres sites, il provoque diverses maladies telles que l'otite, la pneumonie, la bactériémie et la méningite, tuant plus d'un million de personnes par an dans le monde.

Cellules de pneumocoque à différentes étapes de division, observées par microscopie électronique

Le PG est une maille tridimensionnelle constituée de chaînes de glycanes réticulées par des ponts peptidiques. Sa synthèse débute dans le cytoplasme où une cascade d'enzymes synthétise un précurseur appelé le lipide II, un disaccharide-pentapeptide lié à un lipide, positionné sur la face interne de la membrane cytoplasmique. Chez de nombreuses espèces Gram-positives, le deuxième résidu du peptide est une D-iso-glutamine, qui résulte de l'amidation d'un D-glutamate par le complexe cytoplasmique essentiel MurT/GatD. Notre étude structure-fonction de MurT/GatD de S. pneumoniae a révélé l'interface moléculaire du complexe et les résidus impliqués dans son activité amidotransférase, apportant des éléments fondamentaux pour le développement de nouveaux antibiotiques (Morlot et al., Nat. Commun., 2018).

Structure cristallographique du complexe MurT-GatD du pneumocoque (panneau de gauche) ; modélisation des substrats dans le site actif de MurT (panneau du millieu) ; défauts morphologiques causés par la déplétion de MurT-GatD (panneau de droite)

Les deux derniers résidus du pentapeptide sont des D-alanines (D-Ala), ajoutées par la ligase MurF sous la forme d'un dipeptide D-Ala-D-Ala (appelé DADA par la suite). Une fois formé, le lipide II est transloqué vers la face externe de la membrane où il est polymérisé et réticulé au réseau de PG existant par les Penicillin-Binding Proteins (PBPs) et les protéines SEDS (Shape Elongation, Division and Sporulation). Pour atteindre ses propriétés finales (composition, forme, élasticité), le PG nécessite un clivage partiel par des hydrolases, une N-désacétylation et une O-acétylation de ses chaînes glycanes, et une décoration par des macromolécules telles que les TA.
Malgré l'importance du PG pour la prolifération et la survie des cellules, nous comprenons encore mal comment il est assemblé et remodelé dans l'espace et le temps pour assurer la division, la forme et l'intégrité des cellules. Ceci est particulièrement vrai pour les bactéries de forme ovoïde telles que les streptocoques et les entérocoques, chez lesquelles deux modes différents d'assemblage du PG, dédiés à la division cellulaire (synthèse de PG septal, sPG) et à l'élongation (synthèse de PG périphérique, pPG), sont confinés dans une région annulaire dont les dimensions flirtent avec la résolution de la microscopie de fluorescence conventionnelle, qui est limitée par la diffraction de la lumière ( 250 nm). En effet, la protéine de division majeure FtsZ, qui recrute les synthases de PG au début du cycle cellulaire, forme une structure annulaire (appelée anneau Z) d'une centaine de nanomètres de large, comme le montre notre étude de FtsZ en microscopie super-résolue PALM (PhotoActivated Localization Microscopy) (Jacq et al., mBio, 2015).
Pour comprendre comment le PG est assemblé et maturé à haute résolution spatiale et temporelle, nous étudions sa biosynthèse par des techniques de marquage métabolique, de microscopie de localisation à molécule unique et de génétique microbienne (Collab. C. Grangeasse, MMSB Lyon ; YS Wong, DPM). Le marquage est réalisé par incorporation métabolique de dérivés de D-alanine dans le PG en expansion. Ces sondes portent des fonctions chimiques qui permettent leur conjugaison à des molécules fluorescentes par chimie click (Trouve et al., STAR Protoc., 2021). Les cellules marquées sont ensuite observées par microscopie super-résolue dSTORM (direct STochastic Optical Reconstruction Microscopy) pour observer l'assemblage et le remodelage du PG à l'échelle nanométrique au cours du cycle cellulaire de S. pneumoniae video. Grâce à cette approche, nous pouvons localiser les sites de synthèse du PG, détecter des variations dans les dimensions des régions de synthèse avec une précision de 30 nm et quantifier les quantités relatives de PG synthétisé. Nous utilisons ensuite nos données expérimentales pour simuler la morphogenèse d'une cellule ovoïde in silico et tester diverses hypothèses concernant la dynamique de synthèse du PG. Nos résultats ont révélé que la morphogenèse des ovocoques repose sur la synthèse de sPG, qui est ensuite clivé à sa périphérie pour former la paroi latérale, dans laquelle est inséré le pPG (Trouve et al., Curr. Biol., 2021).
Nous appliquons maintenant notre approche à des souches mutantes, afin d'élucider la fonction des gènes impliqués dans l'assemblage et le remodelage du PG.

A. Marquage métabolique des composants de la paroi par incorporation de sondes cliquables dans les précurseurs du PG ou des TA. B. Localisation par dSTORM du PG marqué, observé juste après le marquage (expérience PULSE) ou après une période de maturation (PULSE-CHASE). C. Illustration 3D d'un stade de division intermédiaire montrant la synthèse de PG septal au niveau du front d'invagination de la membrane, le clivage du septum à sa périphérie et l'insertion de PG périphérique. Les nouveaux hémisphères qui en résultent contiennent un mélange de PG septal et périphérique.

Assemblage et maturation des acides téichoïques

Collaborations :

C. Grangeasse, MMSB, Lyon
YS. Wong, DPM, Grenoble
C. Laguri (Team headed by F. Fieschi), IBS, Grenoble
C. Moriscot & B. Gallet (Team headed by G. Schoehn), IBS, Grenoble

Par rapport au PG, notre connaissance de la dynamique de synthèse et de maturation des acides teichoïques (TA) est beaucoup plus limitée. Ces lacunes sont d'autant plus dramatiques que les TA sont impliqués dans un large éventail de processus, notamment la morphogenèse et la division cellulaire, l'autolyse, la formation de biofilms, l'adhésion aux tissus de l'hôte et l'infection, l'homéostasie ionique, la sensibilité aux antibiotiques et aux peptides antimicrobiens cationiques. Les TA jouent un rôle particulièrement important chez S. pneumoniae, où ils sont décorés de résidus phosphorylcholine (PCho) qui retiennent et, dans certains cas, activent les Choline-Binding Proteins (CBPs) à la surface de la cellule (Frolet et al., BMC Microbiol., 2010). Les CBPs sont impliquées dans le remodelage du PG (insertion de nouveau matériel, séparation des cellules filles), l'autolyse, la compétence et les interactions avec les cellules hôtes (Bonnet et al., Cell Surf, 2018). Par conséquent chez S. pneumoniae, les Cho confèrent aux TA des rôles cruciaux dans la physiologie, la division et la virulence de la cellule.
Les TA sont des polysaccharides linéaires complexes, assemblés à partir d'un précurseur commun, qui peut être transféré sur le PG (WTA pour Wall Teichoic Acids) ou ancré à la membrane cytoplasmique (LTA pour LipoTeichoic Acids). La synthèse et la maturation des TA sont peu décrites dans la littérature car la plupart des souches bactériennes ne possèdent pas de constituants spécifiques des TA permettant un marquage sans ambiguïté. Nous avons développé une méthode pionnière de marquage des TA (Collab. YS Wong, DPM), basée sur l'incorporation de dérivés de Cho cliquables, conjugués à un fluorophore portant une fonction cliquable correspondante (Bonnet et al., ACS Chem Biol, 2018).
Nous avons récemment optimisé le marquage des TA pour le dSTORM et établi une méthode biochimique pour isoler les WTA et les LTA, et les observer par électrophorèse sur gel. En utilisant cette combinaison de techniques, ainsi que la RMN (Collab. C. Laguri, IBS), la microscopie électronique cellulaire (Collab. G. Schoehn, IBS) et la génétique microbienne (Collab. C. Grangeasse, MMSB, Lyon), nous étudions les mécanismes de synthèse et de maturation des TA chez S. pneumoniae, ainsi que leur interaction avec les processus associés au PG.

A. Localisation dSTORM des TA dans une souche de pneumocoque sauvage (gauche) ou délétée de tacL (droite). B. Analyse SDS-PAGE de preparations de TA marqués. C. Image CEMOVIS (cryo-EM of vitreous section) de l'enveloppe du pneumocoque, montrant la couche de TA dans l'espace périplasmique (PS), compris entre la couche de PG et la membrane cytoplasmique (CM).

Membranes

Collaborations :

J. Jouhet, IRIG, CEA Grenoble.

Les enzymes qui synthétisent la paroi cellulaire et la plupart des protéines morphogénétiques sont des protéines membranaires. Les précurseurs du PG et des TA sont également membranaires. Nous avons étudié le rôle de la nature des lipides membranaires dans la morphogenèse. En utilisant une combinaison de sondes lipidiques fluorescentes, nous avons découvert l'existence de différentes phases lipidiques physiques localisées selon la géométrie cellulaire. Les phases lipidiques peuvent à leur tour localiser des protéines morphogénétiques (Calvez et al. Front. Microbiol., 2019).

Ségrégation de phases lipidiques L-alpha marquées par le composé DOPE (rouge) au niveau des anciens hémisphères dans des cellules de pneumocoque. FtsZ est marquée en vert et sert de référence pour la progression du cycle cellulaire.

Résistance aux bêta-lactamines

Collaborations :

S. Fort, CERMAV, Grenoble
C. Contreras-Martel (Group headed by A. Dessen), IBS, Grenoble

Les protéines de liaison à la pénicilline (PBPs) sont les cibles des bêta-lactamines, qui sont les antibiotiques les plus utilisés (pénicillines, céphalosporines, carbapénèmes). Les PBPs sont des transpeptidases qui catalysent la réticulation du PG. Les pathogènes tels que Staphylococcus aureus, les entérocoques, Neisseria ssp. et S. pneumoniae deviennent résistants aux pénicillines par expression de PBPs de faible affinité pour les bêta-lactamines. Ces médicaments ayant une structure qui imite celle du substrat naturel des PBPs, comment les PBPs des souches résistantes ont-elles perdu leur réactivité aux bêta-lactamines tout en conservant leur fonction enzymatique ?
Bien que la réaction entre les PBPs et les β-lactamines soit bien comprise sur le plan cinétique et structural, la réaction de transpeptidation catalysée par les PBPs a été peu étudiée en raison de la difficulté à produire des substrats synthétiques. Les progrès réalisés dans le domaine de l'enzymologie des PBPs ont récemment permis de découvrir certaines exigences relatives aux substrats de la réaction de transpeptidation, mais les informations structurales sur l'interaction PBP-substrat font toujours défaut. Nous avons mis en place une approche chemo-enzymatique qui permet de synthétiser des fragments de PG de taille définie (Collab. S. Fort, CERMAV), que nous utilisons pour caractériser l'interaction entre les PBPs et leurs substrats, en combinant la cristallographie aux rayons X et la RMN avec de l'enzymologie et des mesures d'affinité. En particulier, nous étudions des variants de PBPs provenant de souches de pneumocoque sensibles et résistantes aux bêta-lactamines.
Ces travaux devraient permettre une compréhension fine du mécanisme enzymatique catalysé par les PBPs, d'élucider la raison pour laquelle certaines bêta-lactamines de dernière génération sont actives contre des souches résistantes à des molécules plus anciennes, et d'améliorer les antibiotiques existants pour les rendre plus efficaces.

Distribution des mutations portées par PBP2b issue d'une souche de pneumocoque résistante à la pénicilline.

Stratégies antibactériennes innovantes pour combattre le pneumocoque

Collaborations :

Y.S. Wong, DPM, Grenoble
I. Pelloux, CHU, Grenoble

La lutte contre la résistance aux antibiotiques est un enjeu majeur de santé publique et nécessite de trouver constamment de nouvelles solutions pour combattre les infections bactériennes. Nous explorons de nouvelles stratégies antibactériennes basées sur le marquage métabolique de la paroi cellulaire par chimie click (Collab. YS Wong). D'un point de vue chimique, la création de liaisons chimiquement contrôlées dans un environnement vivant reste un défi majeur. Nous avons synthétisé de nombreuses sondes PG et TA cliquables, testé leur capacité à s'intégrer dans la paroi du pneumocoque et à réticuler ses deux principaux composants, le PG et les TA. Ce travail a conduit au développement de nouvelles sondes de la paroi, fournissant des outils pour le co-marquage du PG et des TA. En outre, nous avons identifié des paires de molécules cliquables qui réticulent artificiellement la paroi cellulaire du pneumocoque, inhibant ainsi sa croissance.

Identification de molécules cliquables qui inhibent la croissance du pneumocoque. La croissance cellulaire est évaluée par observation de la localisation de composants pariétaux marqués en microscopie de fluorescence (A), par analyse de démographes (B), et par suivi de la densité optique de cultures bactériennes (C).