IBS - Institut de Biologie Structurale - Grenoble / France

Photo-Commutation Positive : Un Nouveau Mécanisme Induit par la Lumière (2025)

BRUTSCHER Bernhard — 2025-04-24T15:05:50Z

Les protéines fluorescentes photoconvertibles (PCFPs) comme mEos4b changent leur émission de fluorescence du vert au rouge sous illumination à 405 nm, ce qui en fait des marqueurs essentiels pour les techniques de super-résolution telles que la Microscopie de Localisation de Molécules Uniques (SMLM). Cependant, leurs propriétés photophysiques ne cessent de révéler de nouvelles surprises. En plus de la photoconversion, les PCFPs peuvent commuter de manière réversible entre des états fluorescents et non fluorescents. Sous sa forme rouge, mEos4b subit une "commutation négative" : elle s'éteint sous la lumière à 561 nm et se réactive sous la lumière à 405 nm en raison de l'isomérisation cis-trans du chromophore. Dans cette collaboration entre les groupes I2SR et RMN de l'IBS, et le laboratoire SyMMES de l'IRIG, nous avons identifié un nouveau mode de "commutation positive" : la lumière à 405 nm éteint mEos4b rouge, tandis que la lumière à 561 nm la rallume — l'inverse de la commutation négative. En utilisant la spectroscopie UV-vis, l'imagerie par fluorescence, la RMN et la RPE, nous avons découvert que cette commutation positive provient d'une hétérogénéité conformationnelle induite par la lumière. Le travail montre que la forme rouge de mEos4b existe sous deux états fluorescents, distincts par leurs réseaux de liaisons hydrogène autour du chromophore. Sous illumination à 405 nm, l'état moins fluorescent s'accumule, tandis que la lumière à 561 nm ou l'obscurité favorise l'état plus lumineux. Notamment, l'état moins fluorescent possède un pKa plus élevé, ce qui le rend presque non fluorescent et de longue durée de vie à pH physiologique ou acide. Cette commutation positive entraîne un phénomène de clignotement (blinking) en SMLM, soulignant comment de subtils modifications conformationnelles induites par la lumière, souvent indétectables par cristallographie, impactent profondément l'imagerie de molécules uniques.

Journal of the American Chemical Society. (2025), Doi : 10.1021/jacs.4c17311

EL222 mise en lumière : Comment un photorécepteur module l'expression génique (2025)

BRUTSCHER Bernhard — 2025-04-24T12:53:45Z

La protéine EL222 de la bactérie marine Erythrobacter litoralis régule l'expression génique en réponse à la lumière bleue. Cette régulation se fait par des modifications conformationnelles déclenchées par l'activation d'une petite molécule à l'intérieur de la protéine, appelée flavine mononucléotide (FMN). Afin de mieux comprendre le fonctionnement de cette protéine, nous avons étudié les changements chimiques et structuraux d'EL222 sous exposition à la lumière bleue en combinant la cristallographie aux rayons X, les spectroscopies RMN et optique et des simulations de dynamique moléculaire. Dans ce travail collaboratif impliquant le groupe de RMN de l'IBS et des chercheurs de l'Institut de biotechnologie de l'Académie des sciences en république tchèque, nous révélons qu'EL222 passe par deux états distincts activés par la lumière, chacun étant lié à des changements chimiques spécifiques du FMN. Bien qu'EL222 soit principalement monomérique dans l'obscurité, l'exposition à la lumière favorise la formation de dimères, ce qui accroît sa liaison à un ADN double brin. Fait surprenant, toutes les formes d'EL222 peuvent s'associer à l'ADN, mais le déplacement de l'équilibre vers des complexes stables nécessite une exposition à la lumière bleue. Cette étude propose un nouveau modèle d'activation, où les modifications chimiques induites par la lumière au niveau du FMN générèrent une conformation ouverte de la protéine qui facilite l'auto-association et la liaison à l'ADN. Elle ouvre également la voie à l'optimisation des outils optogénétiques basés sur EL222 en ajustant l'intensité lumineuse afin de régler plus précisément les niveaux d'expression des gènes.

Nucleic Acids Research, 2025, 53, doi : 10.1093/nar/gkaf215

Zoom sur l'environnement du chromophore d'une protéine fluorescente (2021)

BRUTSCHER Bernhard — 2024-07-30T13:57:22Z

Sommaire

Collaboration :

Les protéines fluorescentes de la famille des GFP qui changent d'état fluorescent lors de l'illumination à des longueurs d'onde spécifiques sont des marqueurs largement utilisés pour les modalités d'imagerie à super-résolution. Cependant, les propriétés photophysiques de ces protéines dépendent crucialement des conditions environnementales dans lesquelles elles sont exprimées et utilisées. Actuellement, les stratégies basées sur la conception rationnelle pour améliorer les protéines fluorescentes exploitent principalement les informations mécaniques disponibles à partir des structures cristallographiques aux rayons X, qui manquent d'informations importantes sur la dynamique conformationnelle, les états de protonation et les liaisons hydrogène, ainsi que leur dépendance aux conditions physico-chimiques.
Dans ce travail collaboratif impliquant les groupes RMN et I2SR, nous nous sommes concentrés sur rsFolder, une protéine fluorescente verte réversiblement commutable, conçue à l'IBS. Nous avons démontré que la spectroscopie RMN en solution peut détecter des changements subtils dans l'environnement du chromophore avec une résolution atomique, fournissant de nouvelles perspectives sur la dépendance au pH des propriétés de commutation photo-observées de rsFolder. Nos résultats peuvent être exploités pour concevoir et tester de nouvelles variantes de protéines fluorescentes avec une robustesse accrue face aux changements environnementaux. Ce travail introduit également la spectroscopie RMN dans le domaine de la recherche sur les protéines fluorescentes en tant que nouvel outil pour sonder les populations d'états du chromophore et la dynamique en fonction de diverses conditions environnementales.
Publication : Christou et al. J. Am. Chem. Soc. 2021, 143, 19, 7521–7530, doi : 10.1021/jacs.1c02442

Collaboration :

D. Bourgeois (IBS

L'hétérogénéité conformationnelle dans mEos4b affecte ses propriétés photophysiques (2023)

BRUTSCHER Bernhard — 2024-07-30T13:52:08Z

mEOS4b_Green_heterogeneity

Les protéines fluorescentes photoconvertibles (PCFP) telles que mEos4b changent de couleur de fluorescence, passant du vert au rouge, lorsqu'elles sont illuminées par de la lumière UV. Elles sont des marqueurs populaires pour les modalités d'imagerie à super-résolution telles que la microscopie de localisation de molécule unique quantitative et de suivi de particules individuelles (SMLM). Cependant, les propriétés photophysiques de ces protéines sont extrêmement complexes. Dans ce travail collaboratif impliquant les groupes RMN et I2SR de l'IBS, nous avons observé par spectroscopie RMN multidimensionnelle que mEos4b présente deux conformations distinctes dans l'état vert qui s'interconvertissent lentement. La RMN a également révélé que ces conformations diffèrent par les états de protonation de deux chaînes latérales d'acides aminés dans la poche du chromophore, ce qui modifie le réseau de liaisons hydrogène. Ces réarrangements subtils n'étaient pas visibles dans les structures aux rayons X à haute résolution de mEos4b.
Il est important de noter que seule l'une de ces conformations se photoconvertit efficacement à l'état rouge, tandis que l'autre semble être plus sujette au photoblanchiment. Cette étude aide à expliquer le comportement photophysique complexe observé de mEos4b et des PCFP similaires. Plus généralement, elle révèle comment la dynamique conformationnelle des protéines fluorescentes affecte leurs propriétés photophysiques, en particulier les mécanismes de photoconversion des PCFP dérivés de mEos. Enfin, nos résultats ouvrent la voie à la conception de nouvelles variantes de PCFP avec une efficacité de photoconversion supérieure.
Maity et al. Adv. Sci. 2023, 2306272, doi : 10.1002/advs.202306272
Collaboration : D. Bourgeois (IBS)

Transitions conformationnelles de l'ARN et activité de protéines chaperones de l'ARN (2017)

FAVIER Adrien — 2022-11-10T16:43:15Z

Les protéines chaperonnes aident les ARN à adopter leurs états fonctionnels pertinents. On sait cependant peu de choses sur les détails mécanistiques de l'activité chaperonne de l'ARN. Nous avons utilisé une combinaison de méthodes de RMN en temps réel et en régime permanent pour déchiffrer les voies de formation du duplex d'ARN de deux épingles à cheveux d'ARN complémentaires, ainsi que l'activité chaperonne de la petite protéine bactérienne de choc froid CspA sur cette réaction de repliement.
Collaborations : C. Kreutz (Innsbruck, Autriche), R. Konrat (Vienne, Autriche)

Structure transitoire d'une protéine virale intrinsèquement désordonnée (2015)

FAVIER Adrien — 2022-11-10T16:40:22Z

La protéine non structurelle 5A (NS5A) du virus de l'hépatite C joue un rôle important dans la réplication virale et la formation des particules. Les 250 résidus de l'extrémité C-terminale sont très désordonnés et présentent de nombreux sites d'interaction avec d'autres protéines virales et hôtes. Notre étude RMN a révélé la présence de structures α-hélicoïdales transitoires dans 4 régions de la séquence peptidique qui sont partiellement stabilisées par des interactions tertiaires à longue portée. Deux de ces régions α-hélicoïdales transitoires forment un motif de liaison non canonique pour une liaison de faible affinité avec les domaines SH3, et une compaction partielle lors de la phosphorylation de la protéine.
Collaborations : D. Willbold (FZ Jülich, Allemagne)

Dynamique conformationnelle de rsFolder induite par la lumière (2019)

FAVIER Adrien — 2022-11-10T16:37:16Z

Les protéines fluorescentes phototransformables (PTFP) sont des outils essentiels pour la microscopie à super-résolution (SR). L'ingénierie rationnelle des protéines fluorescentes exploite les informations mécanistiques disponibles à partir des études structurelles, principalement la cristallographie aux rayons X, afin de concevoir de nouvelles variantes de PTFP avec des propriétés améliorées pour des applications particulières. Nous appliquons ici la spectroscopie RMN en solution pour étudier les changements induits par la lumière dans la dynamique conformationnelle de rsFolder, une protéine fluorescente à commutation réversible. La vue dynamique offerte par la RMN met en évidence les régions de la protéine qui comprennent des points de mutation potentiellement intéressants pour de futures campagnes de mutagenèse.
Collaborations : D. Bourgeois (IBS Grenoble)

Étude en temps réel par RMN des états transitoires des protéines (2013)

FAVIER Adrien — 2022-11-10T16:33:02Z

Identification et caractérisation d'un processus d'échange monomère-dimère dans l'état excité de la b2 microglobuline par une combinaison de RMN en temps réel et de RMN de relaxation-dispersion CPMG. Cet état conformationnel a été montré précédemment dans notre équipe comme étant 7 fois plus enclin à l'agrégation que l'état natif.
Collaborations : A.Corazza, G. Esposito (Univ. d'Udine, Italie) ; V. Forge (iRTSV, CEA Grenoble, France)