IBS - Institut de Biologie Structurale - Grenoble / France

Développement des microscopies qPALM, cryoPALM et sptPALM

Bourgeois Dominique — 2022-11-30T14:01:46Z

Nous développons la microscopie super-résolution PALM, une des principales méthodes de localisation de molécules uniques (SMLM). Dans notre définition, les techniques PALM rassemblent l'ensemble des techniques de type SMLM utilisant des protéines fluorescentes phototransformables (PTFPs) comme marqueurs. Le PALM et ses dérivés qPALM, cryoPALM et sptPALM sont fondamentalement basés sur les propriétés photophysiques de ces PTFPs, ce qui fait la cohérence de nos activités.

Notre microscope PALM est utilisé pour étudier les PTFPs in cellulo ou in vitro au niveau de la molécule unique. Nous menons 3 activités principales :

– Nous développons la microscopie PALM à température cryogénique (cryo-PALM) qui constitue une des évolutions majeures du domaine actuellement, notamment pour les applications en biologie structurale intégrée basées sur la microscopie corrélative (cryo-CLEM). Pour ce projet nous bénéficions d'un cryo-microscope développé par l'équipe allemande de Jörg Enderlein (Université de Göttingen). Notre but consiste à d'étudier les propriétés de photocommutation des PTFPs à basse température, à réaliser l'ingénierie de protéines fluorescentes mieux adaptées au cryo-PALM, ou à améliorer les protocoles d'illumination laser lors d'une collecte cryo-PALM. Par exemple, nous avons récemment découvert un nouveau mécanisme de photocommutation se produisant à température cryogénique chez rsEGFP2, et montré qu'une illumination à 355 nm permettait d'augmenter l'efficacité de marquage.

– Nous étudions comment la photophysique des protéines fluorescentes photoconvertibles telles que les variants de mEos affectent les techniques qPALM et sptPALM. Par exemple, nous avons trouvé une méthode pour augmenter la longueur des traces en sptPALM avec les variants de mEos, en ajoutant une faible illumination à 488 nm pendant la collecte des données. Nous avons aussi récemment montré que, en raison d'un mécanisme de photoblanchiment non linéaire, l'utilisation de fortes intensités de lumière à 405 nm peut être très délétère pour l'efficacité de marquage en qPALM. Enfin, notre travail en collaboration avec le groupe RMN de l'IBS a permis de découvrir l'existence de plusieurs états conformationnels chez les protéines mEos comme mEos4b, à la fois dans leurs états vert et rouge, avec des conséquences sur les mécanismes de photoconversion et de scintillement (blinking) dans les expériences PALM.

– Nous développons un simulateur d'imagerie de molécules uniques appelé SMIS qui, contrairement à tous les simulateurs disponibles à ce jour, intègre une description avancée des propriétés spectrales et photophysiques des fluorophores. SMIS permet d'effectuer des simulations complexes capables de prédire par exemple les effets de diverses conditions d'illumination dans une expérience PALM, ou les effets subtils de crosstalks dans des expériences SMLM multicouleurs.

Etudes mécanistiques et ingénierie des protéines fluorescentes

Bourgeois Dominique — 2022-11-30T13:42:13Z

L'un de nos thèmes centraux concerne les études photophysiques des protéines fluorescentes phototransformables (PTFP). Les PTFP sont des acteurs fondamentaux de la microscopie à super-résolution ainsi que d'autres méthodes de fluorescence avancées, telles que l'imagerie "pulse-chase", l'imagerie par illumination modulée, le transfert d'énergie par résonance de Förster (FRET) photochromique ou le stockage de données biologiques.

Ces marqueurs de fluorescence génétiquement encodés sont fascinants car leur état de fluorescence peut être modifié par illumination avec une lumière laser appropriée.
– Par exemple, la couleur d'émission de certaines PTFPs peut passer du vert au rouge par illumination avec de la lumière violette (ce que l'on appelle les FP photoconvertibles, PCFPs).
– D'autres PTFPs peuvent passer de manière réversible de l'état fluorescent à l'état non fluorescent (ce que l'on appelle des FPs réversiblement photocommutables, RSFPs), par exemple en alternant la lumière cyan et la lumière violette pour des RSFPs qui fluorescent dans le vert.

Les propriétés de phototransformation telles que la photoactivation, la photoconversion et la photocommutation doivent être comprises et optimisées pour chaque application. En outre, le clignotement (perte stochastique et transitoire de fluorescence) et le photoblanchiment (perte irréversible de fluorescence) sont des propriétés photophysiques cruciales qui sont observées chez toutes les protéines fluorescentes et que nous étudions en détail, bien qu'elles cachent encore de nombreux mystères.

De nombreux groupes dans le monde étudient et développent des protéines fluorescentes pour créer des marqueurs ou des capteurs toujours plus performants. Nous contribuons à ce domaine de recherche en étudiant les PTFPs à l'aide d'un vaste ensemble d'outils : nous utilisons généralement une combinaison de cristallographie cinétique (y compris XFEL en collaboration avec le groupe Dynamop), spectroscopie in cristallo, imagerie de molécules uniques in vitro et in cellulo et RMN en collaboration avec le groupe RMN).

Au cours des dernières années, nous avons concentré notre attention sur la photophysique de PCFPs populaires tels que mEos4b. Cette photophysique semble présenter une complexité sans fin, mais nous la comprenons un peu mieux chaque jour. Par exemple, en collaboration avec l'équipe de P. Dedecker (KUL, Belgique), nous avons déchiffré en 2019 un mécanisme majeur de clignotement chez mEos4b rouge, qui provoque habituellement de sérieux problèmes de qualité et d'interprétation des données PALM quantitatives (qPALM) ou sptPALM, et nous avons montré que ce mécanisme est très étroitement lié aux mécanismes de photocommutation réversible en jeu dans les RSFPs. Cela nous a permis de proposer une astuce pour réduire le clignotement en sptPALM, de manière à permettre la reconstruction de tracks plus longues. Nous nous sommes également intéressés à la photophysique de l'état vert dans les PCFPs. En effet, bien que les PCFPs ne sont en général détectés qu'une fois photoconvertis à l'état rouge, ce qui se passe avant la photoconversion affecte considérablement leurs performances en tant que marqueurs SMLM. Par exemple l'efficacité de marquage réelle de mEos4b dépend de manière non linéaire de la puissance laser 405 nm utilisée pour la photoconversion. En collaboration avec les équipes de J.B Sibarita et M. Sainlos (IINS, Bordeaux), nous avons démarré en 2020 un projet financé par l'ANR visant à améliorer encore la photostabilité des PCFPs, en combinant des études structurales, notamment la RMN, avec des approches d'imagerie en molécules uniques à haut débit pour permettre une ingénierie semi-rationnelle efficace. Un objet d'étude important est le lien entre la dynamique conformationnelle des PTFPs et leur photophysique, qui peut être abordé par RMN, aujourd'hui un outil central pour nos recherches. Nous avons par exemple découvert que les protéines mEos existent dans plusieurs états conformationnels, à la fois sous leur forme verte et leur forme rouge. par ailleurs, nous avons découvert que les temps de maturation des variants mEos2,3,4 étaient extrêmement longs, et par une approche rationnelle nous avons réalisé l'ingénierie des protéines mEos4Fast.

– Nous étudions aussi le mécanisme de photocommutation de RSFPs vertes comme rsEGFP2, ou rouges en collaboration avec Dorus Gadella (Université d'Amsterdam). En particulier, nous nous intéressons au mécanismes de photocommutation des protéines fluorescentes à température cryogénique ( 100 K), et nous avons récemment découvert que les mécanismes de photocommutation de rsEGFP2 à température ambiante et cryogénique étaient complètement différents, impliquant une isomérisation cis-trans à température ambiante et probablement la génération d'états radicalaires stables non fluorescents à température cryogénique

Étude de CD47-SIRPa et du cholestérol à la synapse des phagocytes par nanoscopie de fluorescence

2021-02-09T14:33:05Z

Ce projet, mené par Philippe Frachet, Pascale Tacnet, and Quentin Depeyre (doctorant à l'UGA) et en collaboration avec les autres membres de l'équipe PIXEL vise à étudier certains complexes moléculaires impliqués dans l'interaction entre un macrophage et ses cibles potentielles, telles que les cellules apoptotiques et les cellules cancéreuses.

Nous nous intéressons particulièrement au point de contrôle immunitaire CD47-SIRPα, qui joue un rôle clé dans la régulation de la phagocytose. Nos recherches portent sur l'influence du cholestérol membranaire dans ce mécanisme.

Pour cela, nous nous appuyons sur :
• Le développement de sondes protéiques recombinantes, notamment des protéines fluorescentes photovertibles, permettant l'imagerie haute résolution du cholestérol membranaire
• La microscopie confocale et de super-résolution (dSTORM, PALM et sptPALM),
• Une approche dynamique pour analyser, à l'échelle nanométrique, l'organisation de des contacts entre le macrophage et sa cible au cours de la phagocytose (synapse phagocytaire).

Cette étude s'inscrit dans la continuité de nos travaux précédents sur la clairance des cellules apoptotiques (efferocytose) et bénéficie d'une collaboration étroite avec l'équipe d'Arnaud Millet (Mécanobiologie, Immunité et Cancer) à l'IAB- Grenoble.

Au-delà de la caractérisation de la synapse phagocytaire, l'un des objectifs est d'explorer de nouvelles stratégies thérapeutiques anticancéreuses ciblant CD47-SIRPα.

Principales méthodes utilisées : Biologie cellulaire : culture de cellules eucaryotes, test de phagocytose, cytométrie en flux, microscopie à fluorescence. Production de protéines fluorescentes photoconvertibles recombinantes.

Résultats représentatifs : (A) Suivi de particules uniques (SPT) de CD47 à la surface d'une cellule HeLa apoptotique. CD47 est détecté à l'aide d'un anticorps anti-CD47 conjugué à l'AF647, puis imagé en microscopie TIRF PALM/STORM sous une faible puissance laser. Les trajectoires des molécules sont reconstruites et les distances moyennes de saut (Mean Jump Distance, MJD) sont représentées par un code couleur (plateforme d'imagerie de l'IBS). (B) Double détection en STORM de CD47 et de la fixation de SIRPα soluble à la surface d'une cellule en apoptose. Les résultats montrent que SIRPα ne se fixe pas aux corps apoptotiques, caractérisés par une faible teneur en cholestérol. L'image en contraste de phase (BF) correspondante est présentée à droite. Échelle : 10 µm. Données issues de Dufour et al., Communication Biology, 2023.

References

Nanoscale imaging of CD47 informs how plasma membrane modifications shape apoptotic cell recognition. Samy Dufour, Pascale Tacnet-Delorme, Jean-Philippe Kleman, Oleksandr Glushonkov, Nicole Thielens, Dominique Bourgeois & Philippe Frachet Communication Biology (2023)6:207 | https://doi.org/10.1038/s42003-023-04558-y | www.nature.com/commsbio

Calreticulin Release at an Early Stage of Death Modulates the Clearance by Macrophages of Apoptotic Cells. Osman, R. ; Tacnet-Delorme, P. ; Kleman, J.-P. ; Millet, A. ; Frachet, P. Frontiers in Immunology 2017, 8. doi.10.3389/fimmu.2017.01034. Open

Molecular and cellular interactions of scavenger receptor SR-F1 with complement C1q provide insights into its role in the clearance of apoptotic cells Wicker-Planquart, C. ; Dufour, S. ; Tacnet-Delorme, P. ; Bally, I. ; Delneste, Y. ; Frachet, P. ; Housset, D. ; Thielens, N. M. Front. Immunol. 2020, 11. doi. 10.3389/fimmu.2020.00544. Open

Proteinase 3 Interferes With C1q-Mediated Clearance of Apoptotic Cells. Tacnet-Delorme P ; Gabillet J ; Chatfield S ; Thieblemont N ; Frachet P* ; Witko-Sarsat V. Front Immunol. 2018 April DOI : 10.3389/FIMMU.2018.00818. Open

Relative Contribution of C1q and Apoptotic Cell-Surface Calreticulin to Macrophage Phagocytosis. Verneret M, Tacnet-Delorme P, Osman R, Awad R, Grichine A, Kleman JP, Frachet P*. J Innate Immun. 2014 Feb 15

Role of C1q in efferocytosis and self-tolerance : links with autoimmunity. Book title : Autoimmunity - Pathogenesis of Autoimmune Diseases, Clinical Aspects and Therapy of Specific Autoimmune Diseases (ISBN 978-953-51-4188-4) edited by : Dr. Katerina Chatzidionysiou. Philippe Frachet*, Pascale Tacnet-Delorme, Christine Gaboriaud and Nicole Thielens. Intech 2015 DOI : 10.5772/60519