IBS - Institut de Biologie Structurale - Grenoble / France

Microspectrophotomètrie

BYRDIN Martin — 2014-02-19T09:46:00Z

Spectroscopie d'absorption et de fluorescence d'échantillons microscopiques

Sommaire

Microspectrophotomètre Cryogenique d'Absorption/Luminescence CAL(AI)²DOSCOPE

Notre CAL(AI)²DOSCOPE est un appareil permettant l'enregistrement rapide and continu des spectres d'absorption et de luminescence en quasi-synchronie sur des zones exactement identiques d'échantillons microscopiques (nanolitres).

La spectroscopie optique est une méthode versatile pour la caractérisation de nouveaux matériaux, biologiques (protéines) ou non (colorants, nanomatériaux). Elle permet d'étudier d'une manière rapide et non-invasive leur pureté, leurs propriétés électroniques, certains paramètres physico-chimiques, leur stabilité par rapport aux solvants et à la température, etc.
Disposant généralement de quantités très limitées de substances à étudier, il y a une nécessité de miniaturisation de l'échantillon, - d'où le concept de microspectrophotométrie.
Dans un tel instrument, la totalité d'échantillon est illuminé à la fois, ce qui exclut le remplacement des molécules par diffusion. En cas d'illumination intense (comme c'est le cas avec des lasers), le matériau étudié peut alors se dégrader rapidement et il est vivement souhaitable d'étudier les processus d'absorption et de fluorescence avec un décalage minimal.
Concernant la biologie structurale, il existe dans le monde une poignée de microspectrophotomètres combinant absorption et fluorescence soit par une géométrie orthogonale des faisceaux, soit par commutation manuelle entre deux objectifs se faisant face. Par conséquent, ces appareils soit n'observent pas la même zone soit ils ne le font pas au même moment, soit ils ne font aucun des deux.
Notre montage est basé sur un arrangement colinéaire des chemins optiques des deux types de spectroscopies qui utilisent le même objectif et qui sont séparés par des miroirs semi-transparents et/ou dichroïques. Ce principe de construction permet d'empêcher un décalage entre les deux chemins.
La séparation des photons d'absorption et de fluorescence se fait par un basculement rapide entre les sources de lumière et les détecteurs respectifs grâce à un système d'obturateurs contrôlés par ordinateur. Ce système unique a donné son nom anglais à notre instrument :

Cryogenic Absorption/Luminescence Alignment Independent Alternative Illumination Detection Optical microSCOPE

Schème de principe de montage

Caractéristiques / Paramètres

* L'échange rapide entre des miroirs de différents rapports de réflexion / transmission permet d'adapter la distribution des photons entre les différents canaux

* La modularité et l'évolution sont aisées, grâce au couplage des sources de lumière et des détecteurs par des fibres optiques.

* Le montage de type “microscope” couplé à une caméra et le porte-échantillon goniométrique motorisé assurent une flexibilité maximale et une commodité dans la manipulation de l'échantillon et lors de l'alignement, la focalisation du faisceau et le changement d'objectif
.
* Les optiques (objectifs, miroirs, lames séparatrices, détecteurs) ont été optimisées pour une réponse spectrale très lisse dans l'UV/VIS (200-800 nm).

* Un cryostat d'azote gazeux permet de maintenir l'échantillon à des températures contrôlées entre 100 et 300 K.

* Selon le diamètre de la fibre optique utilisée (0,1 à 0,6 mm) et le grossissement de l'objectif (2x à 15x), des diamètres de tâches de 10 à 600 µm peuvent être réalisés, ce qui correspond à des volumes inférieurs au picolitre jusqu'à des volumes inférieurs au microlitre, respectivement.

* Pour la séparation d'excitation et d'émission de fluorescence, des miroirs dichroïques sont disponibles à 405, 488 et 561 nm.

* La résolution temporelle est limitée par l'obturateur et l'acquisition de la puce CCD à > 1 ms.

Applications

Le CAL(AI)²DOSCOPE permet la comparaison des cinétiques de vieillissement d'une protéine fluorescent par absorption et par fluorescence et d'obtenir d'indications pour distinguer la photo-déstruction transitoire (blinking) de celle qui est definitive (bleaching).

Flyer

en cliquant sur l'icone à droite, on peut télécharger un document sommaire décrivant l'instrument en format pdf

Presse

L'instrument a fait en 2016 l'objet d'un article dans le journal "spectroscopy europe"

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Cristallographie cinétique

Bourgeois Dominique — 2014-02-19T09:15:51Z

La cristallographie cinétique des protéines : une nouvelle approche pour visualiser les intermédiaires réactionnels à l'échelle quasi-atomique

La cristallographie cinétique consiste à déclencher la fonction biologique dans une protéine cristallisée, de manière à piéger des changements conformationels fonctionnels. La plupart des structures de protéines résolues par cristallographie aux rayons X correspondent à un état statique de la protéine qui ne représente pas bien l'ensemble des conformations adoptées en réalité par une protéine en action. La cristallographie cinétique des protéines permet d'investiguer la structure d'une manière dynamique. Voir Bourgeois & Weik, Crystallography Rev. (2009) 15,87-118 and Bourgeois & Royant, Curr. Opin. Struc. Biol. (2005) 15, 1-10).
Dans quelques cas très favorables (par exemple dans le cas de la myoglobine) des méthodes ultrarapides comme la diffraction de Laue permettent d'enregistrer des films en temps réel de protéines en action, avec une résolution temporelle approchant les 100 ps. Cependant, ces méthodes sont difficiles à appliquer. Dans un grand nombre de cas, il est alors possible d'utiliser une autre stratégie en piégeant des intermédiaires réactionnels dans le cristal dont les structures sont alors résolues en utilisant les techniques standard de collecte de données. (Pour un exemple dans l'équipe voir Katona et al, Science, (2007), 316, 449-52). Dans ce but, nous avons développé plusieurs instruments et approches méthodologiques fondés sur la photoactivation de chromophores endogènes ou exogènes, un contrôle précis de la température de l'échantillon, et le suivi de la réaction par spectroscopie in cristallo (absorption UV-visible et fluorescence, temps de vie de fluorescence et spectroscopie Raman). Nous appliquons ces techniques au cas des protéines fluorescentes qui sont particulièrement bien adaptées aux approches de cristallographie cinétique.

Mécanisme enzymatique de la superoxyde réductase de Desulfoarculus baarsii. Un résidu lysine importe une molécule d'eau essentielle pour la production de H₂O₂ dans le site actif de la SOR. (Katona et al., 2007 DOI : 10.1126/science.1138885)

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Microscopie super-résolution (PALM)

ADAM Virgile — 2014-02-18T15:11:09Z

Une technique clé pour notre équipe est la déjà très réputée microscopie de localisation photoactivée (PhotoActivated Localization Microscopy, PALM). Grâce à cette méthode d'imagerie, inventée en 2006 [1-3] nous pouvons utiliser et caractériser les protéines fluorescentes phototransformables que nous développons pour les applications d'imagerie de fluorescence avancée. Le principe du PALM est de contourner la résolution optique limitée par la diffraction ( 200-300 nm de résolution) grâce à l'observation d'échantillons fortement marqués, quelques molécules à la fois. La photo-activation d'un nombre très limité de molécules individuelles par cliché acquis (généralement avec un temps d'exposition de quelques ms), permet leur localisation précise en raison de leur séparation spatiale. L'accumulation de milliers de ces clichés, chacun contenant un petit nombre de molécules uniques qui sont observées jusqu'à ce qu'elles photoblanchissent permettra la reconstruction d'une image super-résolue ( 20 nm de résolution).
Notre installation faite maison est équipée de cinq lasers continus (solid-state) dont les longueurs d'onde vont du violet au rouge et les intensités sont comprises entre 50 et 400 mW. Le flux de ces lasers est régulé par un filtre accordable acousto-optique (acousto-optical tunable filter, AOTF) piloté par ordinateur et une lampe blanche est également utilisable pour des longueurs d'onde spécifiques. Notre microscope motorisé inversé (Olympus IX81) est équipé de plusieurs objectifs aux grossissements allant de 5X à 100X, pouvant être couplés à un système anti-dérive "nose-piece" (Olympus). L'illumination de l'échantillon est rapidement commutable entre des modes grand champ direct et fluorescence de réflexion interne totale (TIRF). Un couplage par fibre optique est également disponible pour permettre à un spectrophotomètre d'obtenir une meilleure caractérisation spectrale des échantillons lors de l'acquisition d'images. Un système spécial de détection fait maison permet d'enregistrer des images avec deux caméras EMCCD (Photometrics Evolve 512) sur un à quatre canaux de couleur simultanément.

La salle du microscope PALM et un zoom sur la table optique contenant notre montage.

[1] Betzig, E., et al., Imaging intracellular fluorescent proteins at nanometer resolution. Science, 2006. 313(5793) : 1642-5
[2] Rust, M.J., et al., Sub-diffraction-limit imaging by stochastic optical reconstruction microscopy (STORM). Nat Methods, 2006. 3(10) : 793-5
[3] Hess, S.T., et al., Ultra-high resolution imaging by fluorescence photoactivation localization microscopy. Biophys J, 2006. 91(11) : 4258-72

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Protéines fluorescentes

BYRDIN Martin — 2014-02-04T15:45:24Z

Sommaire

Généralités sur la fluorescence

En 1935, Alexandre Jablonski, physicien polonais, explique le mécanisme de fluorescence à travers un diagramme devenu célèbre : le diagramme de Jablonski. Une molécule fluorescente est capable d'absorber de l'énergie lumineuse et de rapidement re-émettre cette énergie sous forme de fluorescence. L'émission de fluorescence se produit à partir du minimum d'énergie vibrationnelle de l'état S1, vers l'état S0. À partir de l'état excité S1, d'autres chemins de relaxation existent, comme par exemple le déclin non-radiatif par conversion interne ou le croisement inter-système vers l'état triplet T1, qui peut ensuite retourner à S0 par phosphorescence ou subir d'autres réactions photochimiques. Le retour vers l'état fondamental S0 peut aussi s'effectuer de manière non radiative par interaction avec une autre molécule par le phénomène de « quenching ». L'oxygène moléculaire est un quencher très efficace de l'état triplet, du fait de son état fondamental lui-même à l'état triplet.
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La protéine fluorescente verte (GFP)

Dans les années 1960-70, la GFP (Green Fluorescent Protein) est purifiée à partir de la méduse Aequora Victoria puis étudiée en détail par Osamu Shimomura. En 1992, Douglas Prasher parvient à cloner le gène de la GFP sauvage, et en 1994 Martin Chalfie réussit à exprimer ce gène dans la bactérie E. coli et dans le ver C. Elegans. Puis au début du XXIe siècle, Roger Tsien développe des variants de la GFP de multiples couleurs par ingénierie des protéines. En 2008 ces trois chercheurs reçoivent le prix Nobel de chimie pour leur travail sur les protéines fluorescentes. La première structure cristallographique de la GFP est résolue par James Remington en 1996. La GFP a une masse moléculaire d'environ 27 kDa et est composée de 238 acides aminés. La protéine adopte une structure en tonneau beta dont le diamètre est 24 Å et la longueur 42 Å. En forme de cylindre, la GFP est composée de 11 brins anti-parallèles et d'une hélice alpha au centre de laquelle se trouve le chromophore, formé de manière autocatalytique à partir des résidus 64 à 66. Cette structure est largement conservée parmi toutes les protéines fluorescentes, et maintient le chromophore dans une conformation relativement rigide favorisant l'émission de fluorescence, le protégeant aussi, dans une certaine mesure, des interactions avec le solvant.

Le spectre d'excitation de la GFP comporte une bande majeure à 395 nm (chromophore protoné) et une bande mineure à 470 nm (chromophore déprotoné). L'absorption d'un photon dans l'une de ces deux bandes génère de la fluorescence verte à environ 510 nm.
Le chromophore dans son état protoné ne fluoresce presque pas. Suite à une excitation à 395 nm, le résidu protoné Tyr66 du chromophore devient extrêmement acide et transfère son proton vers le Glu222 à travers un réseau de liaisons hydrogène, créant un état déprotoné et un chromophore fluorescent. Ce mécanisme est appelé transfert de proton à l'état excité (ESPT). Après le retour à l'état fondamental, le proton retourne sur le chromophore.
Même dans son état déprotoné, le chromophore de la GFP ne fluoresce pas indéfiniment. À l'échelle de la molécule unique, la fluorescence est sujette à des fluctuations temporelles (clignotement) et, inévitablement, elle finit par cesser irréversiblement (photoblanchiment). Ces processus sont extrêmement nuisibles en microscopie de fluorescence et ne sont pas complètement compris d'un point de vue photophysique.
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Équipe pixel : notre projet de recherche

Une approche sous l'angle de la photophysique pour le développement de marqueurs fluorescents améliorés

Depuis la découverte des protéines fluorescentes, la microscopie s'est enrichie d'un outil de première classe. L'obtention d'images de qualité est intimement liée au comportement photophysique des protéines fluorescentes. Au cours des dernières décennies, les approches combinant études photophysiques et conception raisonnée de nouveaux variants ont permis l'émergence de marqueurs fluorescents améliorés d'intérêt remarquable en biologie. Grâce à la combinaison de techniques de spectroscopie et de cristallographie aux rayons X, nous cherchons à comprendre les bases mécanistiques à l'origine du comportement photophysique des protéines fluorescentes en reliant les données obtenues au niveau atomique à celles obtenues au niveau macroscopique.

Photophysique des protéines fluorescentes phototransformables
Au sein de l'équipe, nous nous intéressons plus particulièrement à la photophysique des protéines phototransformables (PTFPs ). Les PTFPs sont capables, sous l'action d'une lumière actinique, de modifier leurs propriétés de fluorescence. Ces protéines remarquables sont devenues ces dernières années des outils de choix en microscopie super-résolution et pour bien d'autres applications. Nous cherchons en particulier à apporter des éléments de réponse quant aux bases photophysiques des phénomènes suivants :
- le phénomène de photocommutation
des protéines dites photocommutables (ou photochromiques) qui passent réversiblement, sous l'action de lumière actinique, d'un état sombre à un état fluorescent. A l'échelle moléculaire, ce comportement est expliqué par une isomérisation du chromophore, couplé à une protonation de ce dernier, conduisant à une forme distordue non fluorescente.

– le phénomène de photoconversion des protéines dites photoconvertibles
Ces protéines passent irreversiblement, sous l'action d'une lumière actinique violette ou proche U.V., d'un état fluorescent vert à un état fluorescent rouge. A l'échelle moléculaire, cette conversion est le fruit d'un clivage de la chaine principale de la protéine en aval du chromophore. Cette réaction chimique entraine la formation d'une double liaison qui permet alors une délocalisation des électrons plus large sur la tyrosine, l'imidazolinone et l'histidine, formant le chromophore de la forme rouge.

– le phénomène de clignotement (blinking en anglais)
des protéines fluorescentes qui passent réversiblement et aléatoirement, sous l'action de la lumière d'excitation, d'un état fluorescent vers un état non fluorescent et inversement. Les mécanismes qui régissent le clignotement ne sont pas très bien compris. Dans l'équipe (Adam et al, 2009, Roy et al, 2011), nous avons mis en évidence que, chez IrisFP, un chromophore distordu, potentiellement dû à un transfert d'électron et de proton couplé, pourrait être à l'origine du clignotement. Les résultats obtenus à l'échelle moléculaire nous permettent actuellement de travailler au développement de nouveaux variants faiblement clignotants. En effet, le phénomène est connu comme étant responsable de l'apparition d'artefacts en microscopie molécule unique.

– le phénomène de photoblanchiment des protéines fluorescentes qui passent irréversiblement, suite à l'irradiation par la lumière d'excitation, vers un état non fluorescent dit blanchi. Ce phénomène constitue un obstacle majeur en vidéomicroscopie (time lapse microscopy) lorsque l'on souhaite suivre une molécule au cours du temps. Des résultats récemment publiés dans l'équipe (Duan et al, 2013) mettent en évidence l'existence de deux mécanismes différents responsables du photoblanchiement de IrisFP. Ces travaux devraient ouvrir la voie à l'ingéniérie de variants davantage photorésistants.

– à l'effet de l'environnement sur le comportement photophysique des PTFP.
Notamment l'effet du pH, des conditions redox, de la température, du dioxygène et de l'intensité d'excitation.

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La protéine fluorescente verte (GFP)

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