IBS - Institut de Biologie Structurale - Grenoble / France

Photocommutation positive chez mEos4b (2025)

Bourgeois Dominique — 2025-09-08T12:19:49Z

Crédit : IBS/Jip Wulffelé

Les protéines fluorescentes photoconvertibles (PCFPs) comme mEos4b changent leur émission de fluorescence du vert au rouge sous illumination à 405 nm, ce qui en fait des marqueurs essentiels pour les techniques de super-résolution telles que la Microscopie de Localisation de Molécules Uniques (SMLM). Cependant, leurs propriétés photophysiques ne cessent de révéler de nouvelles surprises. En plus de la photoconversion, les PCFPs peuvent commuter de manière réversible entre des états fluorescents et non fluorescents. Sous sa forme rouge, mEos4b subit une "commutation négative" : elle s'éteint sous la lumière à 561 nm et se réactive sous la lumière à 405 nm en raison de l'isomérisation cis-trans du chromophore.
Dans cette collaboration entre les groupes I2SR et RMN de l'IBS, et le laboratoire SyMMES, les chercheurs ont identifié un nouveau mode de "commutation positive" : la lumière à 405 nm éteint mEos4b rouge, tandis que la lumière à 561 nm la rallume — l'inverse de la commutation négative. En utilisant la spectroscopie UV-vis, l'imagerie par fluorescence, la RMN et la RPE, ils ont découvert que cette commutation positive provient d'une hétérogénéité conformationnelle induite par la lumière. Le travail montre que la forme rouge de mEos4b existe sous deux états fluorescents, distincts par leurs réseaux de liaisons hydrogène autour du chromophore. Sous illumination à 405 nm, l'état moins fluorescent s'accumule, tandis que la lumière à 561 nm ou l'obscurité favorise l'état plus lumineux. Notamment, l'état moins fluorescent possède un pKa plus élevé, ce qui le rend presque non fluorescent et de longue durée de vie à pH physiologique ou acide.
Cette commutation positive entraîne un phénomène de clignotement (blinking) en SMLM, soulignant comment de subtils modifications conformationnelles induites par la lumière, souvent indétectables par cristallographie, impactent profondément l'imagerie de molécules uniques.

Light-Induced Conformational Heterogeneity Induces Positive Photoswitching in Photoconvertible Fluorescent Proteins of the EosFP Family. Wulffelé J, Maity A, Ayala I, Gambarelli S, Brutscher B, Bourgeois D. J Am Chem Soc. 2025 ; 147(12):10357-10368. doi : 10.1021/jacs.4c17311.

Remodelage du nucleoïde et variation de la dynamique de la protéine HU chez Deinococcus radiodurans (2024)

Bourgeois Dominique — 2025-02-10T16:42:26Z

La réorganisation du nucléoïde est une stratégie commune de réponse au stress chez les bactéries afin de protéger leur patrimoine génétique. Ce processus est régulé par de petites protéines, les NAPs (Nucleoid-Associated Proteins), qui interagissent avec l'ADN et jouent un rôle clé dans l'organisation et la régulation du génome bactérien.
Par des approches de microscopie avancée, le groupe I2SR, en collaboration avec l'équipe de F. Confalonieri de l'I2BC, a montré que, chez la bactérie radiorésistante Deinococcus radiodurans, l'exposition aux rayons UV-C ou l'entrée en phase stationnaire induit de profonds changements morphologiques et de volume du nucléoïde, ainsi que des modifications de la mobilité de la protéine HU, principale NAP de cette bactérie. Bien que ces deux stress provoquent une rapide compaction du nucléoïde, la diffusion de HU diminue en phase stationnaire alors qu'elle augmente suite aux UV-C, suggérant des réarrangements sous-jacents distincts.
De plus, l'exposition aux UV-C entraine une réorganisation des nucléoïdes en trois étapes : une condensation rapide avec une augmentation de la diffusion de HU, suivie d'une décompaction plus lente pour restaurer la morphologie normale accompagnée d'un retour à la normale de la mobilité de HU, avant enfin la reprise de la division cellulaire. Ces observations illustrent la diversité des processus de remodelage des nucléoïdes et représentent une première étape vers la compréhension des mécanismes impliqués.

Stress-induced nucleoid remodeling in Deinococcus radiodurans is associated with major changes in Heat Unstable (HU) protein dynamics. Vauclare P, Wulffelé J, Lacroix F, Servant P, Confalonieri F, Kleman JP, Bourgeois D*, Timmins J*. Nucleic Acids Res. 2024 ; 52(11):6406-6423.doi : 10.1093/nar/gkae379.

Hétérogénéité conformationnelle de mEos4b révélée par la RMN (2023)

Bourgeois Dominique — 2024-03-04T13:39:03Z

LA RMN RÉVÈLE DE NOUVEAUX SECRETS DES PROTÉINES FLUORESCENTES UTILISÉES EN MICROSCOPIE À SUPER-RÉSOLUTION

Credit photo : Jip Wulffelé (IBS/I2SR)

Les protéines fluorescentes photoconvertibles (PCFP) telles que mEos4b changent leur couleur de fluorescence du vert au rouge lorsqu'elles sont éclairées avec de la lumière UV. Ce sont des marqueurs très utilisés en imagerie à super-résolution, en particulier la microscopie de localisation (SMLM) quantitative et de suivi de particule unique. Les propriétés photophysiques de ces protéines sont toutefois extrêmement complexes. Dans ce travail collaboratif impliquant les groupes RMN et I2SR de l'IBS, les chercheurs ont observé par spectroscopie RMN multidimensionnelle que mEos4b présente deux conformations distinctes à l'état vert qui s'échangent lentement. La RMN a également révélé que ces conformations diffèrent au niveau des états de protonation de deux chaînes latérales d'acides aminés dans la poche du chromophore, ce qui entraîne une modification du réseau de liaisons hydrogène. Ces réarrangements subtils ne sont pas visibles dans les structures cristallographiques à haute résolution de mEos4b . Il est important de noter qu'une seule de ces conformations est capable d'être photoconvertie efficacement vers l'état rouge, tandis que l'autre semble être plus sensible au photoblanchiment. Cette étude permet d'expliquer le comportement photophysique complexe observé chez mEos4b et les PCFPs apparentées. Plus généralement, elle révèle comment la dynamique conformationnelle des protéines fluorescentes affecte leur photophysique, et en particulier les mécanismes de photoconversion des PCFPs dérivées de mEos. Enfin, leurs résultats ouvrent la voie à la conception de nouveaux variants de PCFPs dotées de meilleures propriétés de photoconversion.

Structural Heterogeneity in a Phototransformable Fluorescent Protein impacts its Photochemical Properties. Arijit Maity, Jip Wulffelé, Isabel Ayala, Adrien Favier, Virgile Adam, Dominique Bourgeois*, and Bernhard Brutscher*. Adv. Sci. (2023), 2306272 Doi : 10.1002/advs.202306272

Phagocytose vue par SMLM (2023)

Bourgeois Dominique — 2023-10-27T07:15:58Z

La microscopie de super-résolution de la surface de cellules en apoptose révèle le jeu des molécules impliquées dans leur élimination par phagocytose

Le gain de résolution obtenue grâce à la microscopie de super-résolution STORM a permis de démontrer que la protéine SIRPα n'est plus colocalisée avec son ligand CD47 à la surface des corps apoptotiques.

Des changements dans l'exposition de molécules à la surface de cellules anormales de l'organisme ou bien subissant une mort cellulaire programmée (apoptose), conduisent normalement à leur élimination par des macrophages (phagocytose). Ces modifications sont contrariées dans le contexte tumoral et cela peut empêcher la phagocytose et être également la cause de résistances aux thérapies.
Grâce à la microscopie à fluorescence de super-résolution, encore appelée nanoscopie car permettant d'atteindre une résolution de quelques nanomètres, des chercheurs du groupe I2SR de l'IBS ont étudié la distribution, la diffusion et les interactions de molécules connues pour induire ou bloquer la phagocytose, telles que le CD47, la calréticuline, la phosphatidylsérine ou encore le récepteur SIRPα. Leurs expériences suggèrent que la désorganisation de la bicouche lipidique de la membrane plasmique, en induisant l'inaccessibilité de CD47, aurait une influence sur l'interaction CD47-SIRPα, un point de contrôle immunitaire bien connu pour réguler la phagocytose. En particulier, la teneur en cholestérol de la membrane cellulaire jouerait un rôle central dans le processus de phagocytose (un taux élevé pouvant inhiber la phagocytose, en favorisant l'interaction CD47-SIRPα).
Ce résultat ouvre de nouvelles perspectives pour contrer les mécanismes d'échappement des cellules cancéreuses au système immunitaire.
L'imagerie de super-résolution STORM (Stochastic Optical Reconstruction Microscopy) et le suivi de molécule unique (Single Particle Tracking) ont été réalisés sur les instruments de la plateforme M4D de l'Institut de biologie structurale (membre de l'ISBG, Integrated Structural Biology Grenoble).

Nanoscale imaging of CD47 informs how plasma membrane modifications shape apoptotic cell recognition. Samy Dufour ; Pascale Tacnet-Delorme ; Jean-Philippe Kleman ; Oleksandr Glushonkov ; Nicole Thielens ; Dominique Bourgeois ; Philippe Frachet. Communications Biology 2023 ; 6(1):207. doi : 10.1038/s42003-023-04558-y.

rsEGFP2 dans le froid (2023)

Bourgeois Dominique — 2023-10-27T07:00:36Z

Comment une protéine fluorescente commute t-elle dans le froid ?

Les méthodes de biologie structurale ont souvent bénéficié de leur « version cryogénique ». La cristallographie aux rayons X et la microscopie électronique ont été révolutionnées par la possibilité de refroidir rapidement les échantillons biologiques, ce qui a permis de réduire respectivement, les dommages causés par les radiations ou de mieux préserver l'état natif des macromolécules étudiées. Avec le développement de la microscopie à super-résolution (nanoscopie), la question se pose maintenant de passer à la cryo-nanoscopie. Cette approche a déjà été démontrée par plusieurs laboratoires de premier plan, notamment dans le but de réaliser des études cryo-corrélatives (cryo-CLEM). L'obtention de bonnes images de cryo-nanoscopie se heurte toutefois à un obstacle de taille lorsque la technique SMLM (Single Molecule Localization Microscopy) est utilisée. Pour que cette technique fonctionne, les fluorophores utilisés pour marquer la molécule d'intérêt doivent passer efficacement d'un état non-fluorescent à un état fluorescent. Cependant, dans le cas des protéines fluorescentes, cette propriété de commutation est généralement réduite ou abolie à température cryogénique, car la commutation dépend de la dynamique de la protéine qui est quasiment arrêtée en dessous de la température de transition vitreuse.

Dans ce travail, les membres de l'équipe Pixel du groupe Imagerie Intégrée de la Réponse au Stress (I2SR/Pixel), en collaboration avec l'Université de Göttingen en Allemagne, ont montré que rsEGFP2, une protéine fluorescente qui commute rapidement à température ambiante, commute toujours à 100K, mais selon un mécanisme entièrement différent qui implique probablement des états radicalaires au lieu de l'isomérisation cis-trans du chromophore. En outre, les travaux démontrent que la fraction de molécules rsEGFP2 qui peuvent commuter efficacement avant photoblanchiment est nettement améliorée par l'utilisation d'une illumination UV à 355 nm au lieu de l'illumination violette à 405 nm classiquement utilisée. L'étude ouvre donc la voie à l'obtention d'images cryo-SMLM plus nettes.

Photophysical Studies at Cryogenic Temperature Reveal a Novel Photoswitching Mechanism of rsEGFP2. Angela M. R. Mantovanelli,§ Oleksandr Glushonkov,§ Virgile Adam,§ Jip Wulffelé, Daniel Thédié, Martin Byrdin, Ingo Gregor, Oleksii Nevskyi, Jörg Enderlein, and Dominique Bourgeois. Journal of the American Chemical Society 2023 ; 145(27):14636-14646. doi : 10.1021/jacs.3c01500.

Simulateur SMIS (2023)

Bourgeois Dominique — 2023-07-11T11:55:32Z

La photophysique des fluorophores et la microscopie à super-résolution mariés avec SMIS

La microscopie de localisation à molécule unique (SMLM) est la technique d'imagerie de fluorescence à super-résolution la plus répandue. C'est également la technique qui offre la meilleure amélioration de la résolution et qui est donc la mieux adaptée à l'intégration de la biologie structurale dans le contexte cellulaire. Comme toutes les méthodes de super-résolution, la microscopie SMLM repose fondamentalement sur des propriétés photophysiques spécifiques des fluorophores, comme la photocommutation. Cependant, ses limites sont aussi largement liées à la photophysique complexe -non désirée- des fluorophores.
L'un des principaux objectifs de l'équipe Pixel du Groupe Imagerie intégrée de la réponse au stress est de comprendre comment la photophysique des fluorophores et la microscopie SMLM sont imbriquées. À cette fin, depuis 10 ans, Dominique Bourgeois développe un outil de simulation basé sur Matlab appelé SMIS (Single Molecule Imaging Simulator). SMIS simule un microscope SMLM et génère des jeux de données à partir d'échantillons virtuels tout en tenant compte de la photophysique complexe des fluorophores utilisés. De cette manière, toute sorte de comportements étranges et d'artefacts peuvent être évalués et compris. Profitant du confinement lié au Covid, il a pu finaliser le travail sous la forme d'une GUI (Graphical User Interface) disponible pour la communauté, montrant aussi par un certain nombre d'exemples comment SMIS peut être utilisé pour comprendre les observations. Un projet personnel extrêmement chronophage, mené en parallèle avec les autres projets du groupe I2SR !

Single molecule imaging simulations with advanced fluorophore photophysics. Bourgeois D. Communications Biology 2023 ; 6, 53.

Efficacité de photoconversion de mEos4b (2022)

Bourgeois Dominique — 2022-11-28T10:19:17Z

Les protéines fluorescentes n'aiment pas les coups de soleil !

La microscopie à super résolution continue de mettre à jour de nouveaux aspects de la biologie à l'échelle nanométrique. Les mesures quantitatives utilisant la microscopie à super résolution restent toutefois limitées en raison du comportement photophysique très complexe des marqueurs fluorescents utilisés. Dans le cas des protéines fluorescentes photoconvertibles (PCFPs), leur efficacité limitée de conversion du vert au rouge réduit la résolution spatiale et génère des erreurs de sous-comptage dans les expériences quantitatives. Les chercheurs de l'équipe PIXEL du groupe I2SR de l'IBS ont montré que l'efficacité de la photoconversion de plusieurs PCFPs, notamment mEos4b, Dendra2 et pcStar, dépend fortement des conditions d'illumination. En particulier, l'efficacité de la photoconversion dépend de manière non linéaire de l'intensité lumineuse utilisée à 405 nm, en raison d'un mécanisme de photoblanchiment non linéaire. Les résultats contribuent à notre compréhension de la photophysique des protéines fluorescentes et permettent de concevoir des schémas d'illumination optimisés pour la microscopie de localisation.

mEos4b Photoconversion Efficiency Depends on Laser Illumination Conditions Used in PALM. Wulffele J, Thédié D, Glushonkov O, Bourgeois D. J. Phys. Chem. Lett. 13:5075–5080. DOI : 10.1021/acs.jpclett.2c00933

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Etude par RMN de rsFolder (2021)

Bourgeois Dominique — 2022-11-28T10:01:10Z

Zoom sur l'environnement du chromophore dans une protéine fluorescente par spectroscopie RMN en solution

Les protéines fluorescentes de la famille GFP qui changent d'état lorsqu'elles sont éclairées à des longueurs d'onde spécifiques sont des marqueurs largement utilisés en imagerie super-résolution. Les propriétés photophysiques de ces protéines dépendent toutefois de manière cruciale des conditions environnementales dans lesquelles elles sont exprimées et utilisées. Actuellement, les stratégies basées sur la conception rationnelle pour améliorer les propriétés de ces protéines fluorescentes exploitent principalement les informations mécanistiques disponibles à partir des structures cristallographiques. Or, ces structures manquent d'informations sur la dynamique conformationnelle, les états de protonation et les liaisons hydrogène, ainsi que leur dépendance aux conditions physicochimiques. Dans ce travail de collaboration impliquant les groupes RMN et I2SR, nous nous sommes concentrés sur rsFolder, une protéine fluorescente verte photocommutable qui a été conçue à l'IBS. Nous avons démontré que la spectroscopie RMN en solution peut détecter des changements subtils dans l'environnement du chromophore avec une résolution atomique, ce qui permet de mieux comprendre la dépendance au pH des propriétés de photocommutation de rsFolder. Nos résultats peuvent être exploités pour concevoir et tester de nouveaux variants de FPs plus robustes face aux changements environnementaux. Ce travail introduit également la spectroscopie RMN dans le domaine de la recherche sur les protéines fluorescentes en tant que nouvel outil pour sonder les populations et la dynamique des différentes conformations du chromophore en fonction d'une variété de conditions environnementales.

Disentangling chromophore states in a reversibly switchable green fluorescent protein : mechanistic insights from NMR spectroscopy. Christou NE, Giandoreggio-Barranco K, Ayala I, Adam V, Bourgeois D, Brutscher B. Journal of the American Chemical Society 2021, 143, 19, 7521–7530 DOI : 10.1021/jacs.1c02442

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Blinking de mEos4b dans son état vert (2020)

Bourgeois Dominique — 2022-11-28T09:51:11Z

Les protéines fluorescentes dansent dans le noir

La possibilité de convertir des protéines fluorescentes photoconvertibles (PCFPs) d'un état vert à un état rouge est largement utilisée en microscopie de localisation de molécules uniques. Cependant, l'imagerie de molécules uniques est fortement perturbée par le "clignotement" (c'est-à-dire la perte transitoire de fluorescence), qui résulte du passage de PCFPs individuelles vers des "états noirs". Le clignotement a généralement été décrit à partir de l'état rouge, mais dans cet article, les chercheurs se sont intéressés aux clignotement à partir de l'état vert.
Dans le cadre d'une collaboration entre le groupe DYNAMOP de l'IBS, l'Université KU Leuven (Belgique) et l'Université Paris-Saclay, les chercheurs ont étudié la formation d'états noirs chez mEos4b vert, une PCFP largement utilisée, en utilisant la spectroscopie UV-VIS et Raman, la cristallographie aux rayons X et les simulations MD. Ils ont découvert que la formation d'un état noir majeur provient de l'isomérisation cis-trans du chromophore, de manière similaire à ce qui se passe dans les protéines fluorescentes réversiblement commutables (RSFP). Cependant, ils ont découvert que mEos4b ne peut pas être complètement éteint (c'est-à-dire que son "contraste de commutation" est faible), car son chromophore bouge beaucoup dans l'état noir et revient facilement vers l'état fluorescent. En comparant le nombre d'interactions par liaison H maintenues par le chromophore dans différentes protéines fluorescentes dans leurs états verts et noirs, ils ont pu suggérer que le contraste de commutation dans les RSFPs dépend de la force relative avec laquelle le chromophore est ancré à la matrice de la protéine dans l'état noir par rapport à l'état vert.

Mechanistic Investigations of Green mEos4b Reveal a Dynamic Long-Lived Dark State. Elke De Zitter, Jacqueline Ridard, Daniel Thedie, Virgile Adam, Bernard Levy, Martin Byrdin, Guillaume Gotthard, Luc Van Meervelt, Peter Dedecker, Isabelle Demachy, Dominique Bourgeois. Journal of the American Chemical Society, 2020, ja-2020-01880m DOI : 10.1021/jacs.0c01880

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Etat triplet de EGFP (2018)

Bourgeois Dominique — 2022-11-28T09:42:12Z

Mise en évidence d'un état « fantôme » chez les protéines fluorescentes vertes

Les protéines fluorescentes vertes (GFPs) sont des protéines utilisées comme marqueurs (génétiquement encodés) pour permettre de localiser jusqu'aux protéines individuelles par microscopie optique. Leur fluorophore est formé de trois acides aminés et il se trouve au centre d'un tonneau beta qui le protège de l'environnement. Bien que les GFPs soient doté d'un remarquable rendement d'absorption et de fluorescence, leur fluorophore est capricieux et fragile. Ainsi, il peut entrer dans des périodes dites « obscures » d'inactivité temporaire et après environ 100000 cycles d'excitation et d'émission, il s'éteint définitivement. A l'IBS, l'équipe Pixel a déjà résolu les structures de certains de ces états obscurs. Ils montrent tous des modifications chimiques plus ou moins sévères, ce qui pose la question de leur irréversibilité. On soupçonnait un état en amont où ces modifications ne sont pas encore irréversibles et dont la connaissance permettrait d'améliorer le comportement des GFP. Mais cet état était mal connu : quel est son caractère chimique (triplet, radical, biradical ?), son rendement (pour cents, pour milles ?), son temps de vie (nano-, micro-, millisecondes ?), sa réactivité (oxydative, réductive, les deux ?), et son spectre d'absorption (UV, VIS, IR ?).
Grace à une collaboration avec l'équipe de Klaus BrettelL à l'I2BC (CEA Saclay), l'équipe Pixel du groupe DYNAMOP de l'IBS a soumis l'EGFP – protéine fluorescente paradigmatique - à des études par spectroscopie d'absorption transitoire. Il s'agit d'une technique peu appliquée auparavant aux protéines fluorescentes, que les chercheurs ont poussée aux limites de sa résolution. Cela leur a permis de détecter la signature spectrale de l'état obscur « fantôme » et de le caractériser en répondant à tous les questionnements évoqués ci-dessus. Ces avancées ouvrent la voie pour mieux comprendre le fonctionnement photophysique des protéines fluorescentes et alimentent l'espoir de trouver des clés pour leur optimisation continue.

A Long-Lived Triplet State Is the Entrance Gateway to Oxidative Photochemistry in Green Fluorescent Proteins. Byrdin M, Duan C, Bourgeois D, Brettel K. Journal of the American Chemical Society ;. doi : 10.1021/jacs.7b12755

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