Introduction
L’un des grands succès de la médecine moderne a été l’éradication du virus de la variole déclarée en 1979 après une longue campagne de vaccination avec le prototype du poxvirus, le virus de la vaccine (VACV), qui est également un système modèle sûr. Cependant, la famille des poxvirus comprend des membres ayant un fort potentiel de propagation à partir du règne animal, où les virus de la variole du singe (MPXV) et du cowpox virus présentent le principal risque. Au début de l’été 2022, cette crainte s’est concrétisée par une épidémie de mpox causée par le MPXV, qui se transmet principalement par les rapports sexuels entre hommes. Auparavant, le MPXV a donné lieu à des épidémies locales en République démocratique du Congo et en Afrique de l’Ouest, avec environ 5000 cas par an et un taux de mortalité d’environ 2 %. Même si le nombre de cas diminue actuellement, on ne peut exclure une évolution future du virus mpox vers une transmission plus efficace, une fois qu’il aura été introduit dans la population humaine, où un taux de mutation accru a été observé.
Il est donc essentiel de se préparer aux infections par les poxvirus en disposant d’une gamme d’antiviraux, mais il n’existe à ce jour que deux molécules, le brincidofovir (qui s’est avéré trop toxique lors de l’épidémie actuelle) et le tecovirimat. Une meilleure connaissance de la machinerie unique de réplication de l’ADN et de son interaction avec le démantèlement du virion dans la cellule après infection et l’assemblage des nouvelles particules virales permettra de développer de nouveaux composés (voir [1]).
La réplication du génome du poxvirus est entièrement cytoplasmique et peut se produire même en l’absence du noyau cellulaire. En outre, la machinerie de réplication des poxvirus est unique en raison de la structure du génome qui peut être décrite comme un ADN double brin linéaire circularisé aux extrémités par des boucles en épingle à cheveux. Ces télomères ont une structure particulière car les boucles terminales sont précédées d’un tronçon d’ADN double-brin incomplètement apparié, une séquence conservée de résolution des télomères nécessaire pour former des génomes viraux à partir d’intermédiaires concatémériques et de séquences répétitives terminales (Figure 1).
Figure 1 : A) Organisation du génome du VACV avec le télomère « flip » à gauche et le télomère « flop » à droite, avec une vue zoomée sur séquences répétées. B) L’extrémité de l’épingle à cheveux du télomère « flip » avec une proposition d’appariement de bases obtenue avec le serveur web RNAstructure. La position de l’origine de réplication proposée (flèche rouge) et une partie du site de résolution du concatémère (ligne verte) sont indiquées. (Senkevich et al., 2015.) C) Modèle 3D de l’ADN perturbé obtenu par le serveur Web 3dRNA/DNA, ne tenant pas compte de l’effet des protéines liées.
Notre projet
Nous travaillons sur le virus de la vaccine, qui est identique à 98 % au virus de la variole et au virus de la variole du singe au niveau des acides aminés des protéines essentielles de réplication de l’ADN : l’hélicase-primase D5, l’holoenzyme ADN polymérase constituée de la sous-unité catalytique E9 et le facteur de processivité composé de la protéine accessoire A20 et de l’uracile N-glycosylase D4.
Récemment, nous avons, en même temps d’autres groupes, déterminé la structure de l’holoenzyme polymérase ( [2], Figure 2) et du domaine hélicase de D5 ( [3], Figure 3). Ces progrès pourraient s’appuyer sur la structure tridimensionnelle de ces protéines et de leurs interfaces, déterminée par notre groupe à une résolution croissante, qui a culminé avec la structure aux rayons X de la polymérase E9 [4]. Plus récemment, une structure de l’interface A20-E9 a été obtenue par résonance magnétique nucléaire (RMN) structurelle [5]. La connaissance détaillée des interfaces des différentes sous-unités de la polymérase peut être utilisée pour la conception d’inhibiteurs qui interfèrent avec l’assemblage du complexe protéique.
Figure 2 : Densité obtenue par cryo-EM à 3,9 Å de résolution et modèle de l’holoenzyme polymérase E9-A20-D4. Polymérase E9 : orange ; facteur de processivité A20 : violet ; glycosylase uracyl-ADN D4 : vert
En raison de sa dynamique et de sa flexibilité, la structure à haute résolution de l’hélicase-primase D5 est restée longtemps inaccessible. Nous avons obtenu des premières informations à basse résolution sur la structure et l’organisation des domaines de D5 avec un domaine primase N-terminal et un domaine hélicase C-terminal [6] reliés par un domaine d’oligomérisation et un domaine potentiellement liant le zinc. D5 a été largement étudié par diffusion des rayons X aux petits angles (SAXS), ce qui a également conduit à de nouveaux développements méthodologiques dans la combinaison de la SAXS et de la chromatographie sur colonne.
Grâce à l’évolution rapide de la cryo-microscopie électronique et à la prédiction de la structure par Alphafold2, nous avons obtenu la structure cryo-EM de 4,1 Å du fragment de l’hélicase en complexe avec de l’ADN [2]. Cette structure révèle l’architecture de toute une classe d’hélicases hexamériques présentes dans les bactériophages et dans des éléments d’ADN se répliquant de manière autonome. Cependant, la séparation des brins par l’hélicase D5 n’a pas été clairement démontrée et, comme le montrent les structures, le domaine collier forme toujours un anneau hexamérique fermé (Figure 3). La clé du mécanisme énigmatique de l’entrée de l’hélicase dans la fourche de réplication pourrait résider dans la structure particulière des télomères du génome du poxvirus (Figure 1) où les origines de réplication ont été proposées. Pour cette raison, nous avons débuté l’étude de la structure des télomères et de ses protéines associées.
Pour l’holoenzyme de la polymérase, nous avons obtenu la structure de la forme apo (Figure 2) et nous avons également pu montrer qu’en solution, des formes plus ouvertes doivent être présentes [3]. Malgré la publication récente de plusieurs structures liées à l’ADN, des fonctions de l’holoenzyme, telles que la fonction de relecture ou la synchronisation avec le domaine primase de D5 dans le contexte de la fourche de réplication, ne sont pas comprises. Une publication récente sur le rôle de la protéine H5 en tant que facteur de processivité supplémentaire a montré la nécessité de réexaminer le rôle des facteurs de processivité.
Figure 3 : Reconstruction par cryo-microscopie électronique du domaine hélicase de D5 avec un ADN double brin lié (en vert). Les domaines structuraux sont le collier (en jaune), le domaine AAA+ hélicase (en orange) et le domaine C-terminal en violet.
L’explosion récente des informations structurales nous fournit des instantanés de la machinerie de réplication, qui doivent encore être replacés dans leur contexte, ce qui appelle à davantage de travaux biochimiques sur l’holoenzyme de la polymérase, l’hélicase-primase et leur interaction.
Afin de progresser dans la compréhension de la réplication de l’ADN des poxvirus, nous utiliserons les techniques dans lesquelles notre équipe est spécialisée :la cryo-microscopie électronique (cryo-EM), la cristallographie des rayons X et la diffusion des rayons X aux petits angles (SAXS) combinées à d’autres techniques biophysiques telles que la diffusion de la lumière aux angles multiples (MALS), l’interférométrie des couches biologiques (BLI), l’électrophorèse sur gel de polyacrylamide (PAGE), les tests de déplacement de la mobilité électrophorétique (EMSA), etc.
Nous travaillons en étroite collaboration avec Frédéric Iseni qui dirige le Laboratoire de Virologie de l’IRBA, à Bretigny-sur-Orge, en région parisienne sur la génération de virus mutants afin de valider des résultats des analyses structurales.
Mots clés
poxvirus, réplication d’ADN, polymérase d’ADN, hélicase, primase, facteur de processivité, telomère
Techniques spécialisées
- Production de protéines recombinantes dans les cellules d’insectes et E. coli
- Cristallographie aux rayons X
- Cryo-EM
- Caractérisation biochimique et biophysique (anisotropie par fluorescence, résonance plasmonique de surface, SAXS, dichroïsme circulaire, MALLS, BLI)