Collaboration: Yohan Couté, Edyp
Les toxines bactériennes ciblent des fonctions cellulaires clés afin de favoriser l’infection. Parmi les toxines bactériennes les plus puissantes figurent les phospholipases, qui endommagent la membrane plasmique et entraînent une nécrose ainsi que des lésions tissulaires. P. aeruginosa produit ExoU, une phospholipase exportée et injectée dans le cytoplasme de la cellule hôte par le système de sécrétion de type III (T3SS), aussi appelé injectisome. Nous avons précédemment réalisé deux découvertes majeures : l’une concernant la structure d’ExoU en complexe avec sa chaperonne SpcU [1] (Figure 1), et l’autre portant sur son trafic intracellulaire au sein de vésicules positives contenant DNAJC5 [2] (Figure 2).
Figure 1: The crystal structure of ExoU in complex with its chaperone SpcU (adapted from Gendrin et al. 2012)
Plus récemment, nous avons utilisé des outils de marquage de proximité (proximity labeling, PL) ainsi que des approches cellulaires intégrées afin de mieux comprendre comment ExoU détourne la machinerie de trafic de la cellule hôte. Nous avons fusionné et exprimé l’extrémité C-terminale d’ExoU avec la biotine ligase UltraID. La sécrétion, la cytotoxicité et la dépendance à DNAJC5 de la protéine de fusion ont été confirmées. En présence de biotine exogène, UltraID biotinyle les protéines situées à proximité immédiate d’ExoU. Les protéines capturées par affinité à la streptavidine ont été soumises à une digestion à la trypsine suivie d’une analyse par LC-MS/MS. L’analyse par spectrométrie de masse a révélé huit protéines humaines significativement enrichies dans la condition UltraID par rapport au contrôle, parmi lesquelles RAB27B, SNAP23 et SLC3A2, que nous avons priorisées en raison de leurs rôles connus dans diverses voies de trafic intracellulaire.
En utilisant des cellules invalidées (KO) pour chacune de ces cibles, nous avons mis en évidence l’existence d’un équilibre fin entre la toxicité d’ExoU et les mécanismes de défense de la cellule hôte.
Figure 2: Injection de ExoU et trafic de la cellule hôte (created in https://BioRender.com)